FISH 基本技术和问题解决
试剂、试剂盒 Carnoy 固定液乙醇细胞悬液2 X SSC预热的胃蛋白酶工作液磷酸盐缓冲溶液变性液杂交后洗脱液DAPI 复染液
仪器、耗材 水浴锅增湿器塑料保鲜膜湿度计试管架无尘纸相差显微镜干燥箱DNA探针镊子杂交湿盒温箱
实验步骤
一、制备培养的中期细胞标本
1.在一个独立小室里放置一个水浴锅和一台增湿器。湿度应大约 50%，如果房间湿度计显示低于 45%，则应使用加湿器。
2.预热水浴锅至 67°C±2°C，在水浴锅中央放置试管架以使碰不到水浴锅边缘，整个操作过程保持水位刚好在试管架顶端之下。
3.用 Carnoy 固定液调整细胞悬液的浓度，使悬液轻度混浊即可（见注释 3)。
4.用 70% 乙醇清洗载玻片的两面，用无尘纸将玻片擦干。
5.将清洗过的玻片浸在一缸水中，倾斜载玻片使水均匀覆盖在片子上表面。
6.立刻将片子移至水浴锅上方，拿一支 2~4in(lin=2.54 cm) 的巴斯德吸管，在片子上方沿片子长边滴 3 或 4 滴细胞悬液。
7.将片子放置在水浴中试管架的顶端，有标本面向上，让片子干燥 5~IOmin08. 将片子拿开，在相差显微镜下观察，必要时调整滴片条件。
二、使用可调节细胞遗传干燥器制备中期染色体标本（见注释 4)
1.打开温差电偶真空计，将温度设定为 22°C 和相对湿度设定为 44%，并使之达到稳定状态。
2.用 Camoy 固定液调整细胞浓度，使悬液呈微混浊状（见注释 5)。
3.用 70% 乙醇清洗载玻片两面，并用无尘纸擦干，将片子放置在温差电偶真空计的内表面。
4.握住一支 2~4in 巴斯德吸管，在片子正上方沿着片子的长边滴 3 或 4 滴细胞悬液。
5.观察悬液干燥的情形。悬液在 45~60s 内干燥的情况下制备的标本质量一般较好。
6.在相差显微镜下观察，必要时调整滴片条件。
三、制备未经过培养的标本（见注释 6)
1.小心重悬固定的细胞。
2.每个杂交区域滴 15~20uL 细胞悬液（通常每张片子滴两个区域）
3.气干标本。
4.在相差显微镜下检验细胞密度，如有必要重复 2 和 3 步。
5.过夜老化或在 73°(：的 2\83(：溶液中保温 21^11(见注释 7)。
四、制备尿道上皮细胞标本
1.小心重悬细胞并分别滴 3ul、10uL 和 30uL 悬液在加盖载玻片的 3 个孔中。
2.气干标本。
3.确定哪个样品的细胞密度最佳，即拥有足够数量的非重叠细胞。
4.在相差显微镜下面观察细胞密度，并选择合适的孔进行杂交。
5.过夜老化或在 73°C 的 2XSSC 溶液中保温 2 min(见注释 7)。
五、新鲜细胞的预处理
1.将标本在 73°C 的 2XSSC 中浸泡 2 min。
2.将标本在 37°C 的胃蛋白酶工作液中浸泡 lOmin。
3.将标本在室温的 PBS 中洗 5 min。
4.室温下将标本在处理后固定液中放置 5 min。
5.将标本在室温的 PBS 中洗 5 min。
6.将标本自然风干。
7.将标本在 70% 的乙醇中室温下浸 lmin。
8.将标本在 85% 的乙醇中室温下浸 lmin。
9.将标本在 100% 的乙醇中室温下浸 lmin。
10.可以进行标本变性。
六、石蜡标本的预处理（见注释 8)
1.用钻石笔标出待杂交的石蜡区域。
2.室温下将标本在 Hemo-De 清理试剂中浸 lOmin。
3.将标本在 Hemo-De 清理试剂中重复洗 2 次，每次都使用新鲜的 Hemo-De 清理试剂。
4.室温下，将标本在 100% 乙醇中脱水 5 min。
5.换新的乙醇重复步骤 4。
6.将标本自然风干或将片子在 45?50°C 的片子加热板上放置 2?5 min。
7.将标本在 0.2mol/LHCl 中浸 20 min(见注释 9)。
8.将标本在纯水中浸 3 min。
9.将标本在洗脱缓冲液中浸 3 min。
10.将标本在 80°C 预处理液中浸 30 min。
11.将标本在纯水中浸 lmin。
12.将标本在洗脱缓冲液中浸 5 min。
13.重复在洗脱缓冲液中清洗步骤。
14.用纸巾从载玻片边缘蘸去多余的洗脱缓冲液。
15.将标本在 37°C 的蛋白酶溶液中浸泡 IOmin(见注释 10)。
16.将标本在洗脱缓冲液中浸 5 min。
17.重复在洗脱缓冲液中清洗步骤。
18.将标本在 45~50°C 的标本电热板上干燥 2~5 min。
19.将标本在中性福尔马林缓冲液中室温浸泡 IOmin(见注释 11)。
20.将标本在洗脱缓冲液中浸 5 min。
21.重复在洗脱缓冲液中清洗步骤。
22.将标本在 45?50°C 的标本电热板上干燥 2?5 min。
23.可继续进行杂交操作程序。
七、杂交和洗脱
一定要协调好准备探针的时间和标本变性时间，以便同时完成以备杂交。
1.将标本在 73°C 变性液中浸泡 5 min。一个染缸内一次最多变性 4?6 张载玻片（见注释 12)。
2.将标本浸在室温的 70% 乙醇中 lmin。
3.将标本浸在室温的 85% 乙醇中 lmin。
4.将标本浸在室温的 100% 乙醇中 lmin。
5.用吸水纸从载玻片的边缘吸取多余的乙醇并用纸巾将玻片背面擦干。
6.将探针分装到一个微量离心管中并盖紧，将探针在 73°C 水浴中变性 5 min。
7.在标本上的目标区域加 3~10uL(根据样品区域而定）探针混合液（见注释 13)。
8.立刻在探针上覆盖以 22 mmX22 mm 或一个 12 mm 圆形（本章 3.4 泌尿上皮细胞杂交）盖玻片使探针均匀分布。
9.用橡皮泥封住盖玻片周边。
10.将标本放在 37°C 预热的湿盒中。
11.将杂交标本在 37°C 保温过夜（14?18 h，见注释 14)。
12.用镊子轻轻撕除封片胶。
13.室温下，将标本浸在杂交后洗脱缓冲液中并洗掉盖玻片。
14.从载玻片的一端吸除过量的液体。
15.将载玻片在 73°C 的杂交后洗脱缓冲液中浸洗 2 min。每个染缸一次不得洗脱超过 4?6 张非福尔马林固定的标本，在 2XSSC/0.1%NP-40 中室温浸洗 Imin(见注释 14)。
16.取出片子，将片子垂直放置于暗处风干。
17.加 IOjaLDAPI 复染液到目标区域并盖上 22 mmX22 mm 盖玻片。
18.杂交后标本置于暗处保存。不使用时于一 20°C 保存。
八、间期细胞的信号计数
使用下列各项标准评估片子是否合适（见注释 15~20)。
1.探针信号强度：信号应该是明亮、清晰和易于评估。信号应该是紧密的椭圆形或线状、弥散的椭圆形。
2.背景：背景应该呈深暗或黑色，很少有荧光颗粒或是雾状。.
3.靶信号的识别：使用指定的滤光片。调整焦距，而且要熟悉靶信号和背景噪声 (碎片）的大小和形状。
4.使用 40 乂目镜，扫描一些区域估计细胞类型的异质性。选择一个核分布均匀的区域，避幵靶信号弱的区域。
5.使用 63X 或 IOOX 目镜，开始分析选定区域左上象限，并从左向右扫描，依照指导原则在每个清晰可辨的间期细胞核边界内计数信号。
6.上下调节焦距找到核内所有信号。
7.大小相同，相距小于或等于单个信号直径可计为两个信号。
8.不要对没有信号或当使用两种或更多不同荧光素只有一种颜色信号的核进行计数。只记人那些每种颜色有一个或多个 FISH 信号的核。
