外周血细胞形态学检验及诊断技巧（二）
二．血细胞染色法
（一）细胞染色机理：染色是将细胞经染色剂的物理及化学作用，使其清楚显示细胞各个组成部分，有利辨识细胞形态。
●染色可分二个步骤：
1．染料受相应物质吸附而附着于物质表面；
2．固着作用：
○即染色粒子进入细胞内起化学反应（染料透过细胞膜的学说很 多，尚无定论），与相应的物质形成溶解度很低的盐固着于细胞内而显色。
○染色剂皆有选择作用，其染色不是将细胞全部一齐着色，而只是将其中一部分染色，多余的被冲洗掉。目前多以吸附学说（电力吸附、机械吸附、化学吸附）来解释。
●一般染色方法由两种染色剂（酸性、碱性）组成，通常细胞核及浆碱性粒体为碱性，细胞浆为酸性。
○酸性染料可和带正电荷的（碱性）物质结合，这种物质称嗜酸性物质，对酸性染料具有亲和力，因此嗜酸性粒细胞之颗粒本身为碱性物质；
○碱性染料可和带负电荷的（酸性）物质相结合，这种物质称嗜碱性物质，对碱性染色粒具有亲和力。
○另一种蛋白质在pH6.4 呈等电状态，本身所含的正/负电荷相等，既能和酸性染料又能和碱性染料结合，这种物质称中性物质，如中性粒细胞之颗粒。
●一般用pH6.4 PBS 来稀释染液：
○在恒定条件下着色，使染色效果趋于一致。
○染液过碱时，蛋白质带有负电荷，对次甲蓝有色部分的正电荷吸附力强染成的细胞一般着色较蓝，说明pH不适合。
●染色与固定亦有极大关系：
○因细胞经固定后，其蛋白质的电力吸附（电附）可能有变化，有些固定液能将细胞某部分的电附加强，使其染色更为容易。
○伊红与胞核虽无电附仍有机械吸附，能染上少量红色，苏木液与胞浆虽无电附但也有机械吸附，因而胞浆略显蓝色。
●血细胞的染色多采用瑞氏染色和姬姆萨染色两种，
○作者取其两种染色的优点，采用瑞氏和姬姆萨混合染色法，比单用一种染色法更佳。
○一些快速和改良染色方法及染色液商品化，对血细胞形态染色不一定适用。
（二）瑞氏（Wright's staim；美蓝－伊红Ｙ）染色：
1．瑞氏染料是由碱性染料美蓝（Methvlem blue）和酸性染料黄色伊红（Eostm Y）合称伊红美蓝染料即瑞氏（美蓝－伊红Ｙ）染料。
2．用甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶剂，有两种作用：
（1）甲醇使瑞氏染料中美蓝（M）与伊红（E）在溶液中离解，可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。
甲 醇
ME（瑞氏染料）----→M+ + E-
在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，但不能使胞浆染为蓝色，多余美蓝就可以使胞浆染成蓝色，染色主要是化学作用，是离子彼此结合的反应。
（2）甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。
3.瑞氏染液配制：
(1) 瑞氏染液配制：
瑞氏染料 830gm或1g
甲醇（AR） 500ml或600ml
○先称干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着。
○再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入一清洁储存瓶内（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口。
○存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。
(2) 缓冲液：
●缓冲液作用：
○染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。
○缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，PBS的pH 一般在6.4~6.8，
○偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使pH恒定。
●缓冲液配制（pH6.4~6.8，弱酸性）：
配方1 ： 配方2：
1% KH2PO4 30ml M/15 KH2PO4 73.5 ml
1% Na2HPO4 20ml M/15 Na2HPO4 26.5ml
H2O(新鲜) 加至1000ml
置室温黑暗处，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染则应报废。
（三）姬姆萨（Giemsa's stain；天青-伊红）染色
1．姬姆萨染料是伊红(AzurII Eqsin)和天青（蓝）2号合成的。
2．姬姆萨染料（ Giemsa, 天青-伊红）染液配制：
姬姆萨染料（粉末） 0.5g或7.5g
甲醇（AR） 33ml 或500ml
甘油（AR） 33ml或 500ml
●先将姬姆萨染料放入乳钵中，逐渐倒甘油研磨溶于甘油中，置于56℃水温箱内，90～120分钟，然后加入甲醇，摇匀后放置数天，过滤后或不过滤即可使用。此染液放置室温阴暗处，时间越长越好。
●使用染液可临时配置）：姬姆萨染液1ml，加DDH2O10ml混匀。即可使用。
3．染色步骤：
（1）先用甲醇固定2～3分钟。
（2）将血或骨髓涂片放置姬姆萨使用液15～30分钟。
（3）涂片用自来水冲洗，在室温中干燥待查。
（四）瑞氏或姬姆萨染色液鉴定：刚配好或放置一个月以上的染液可进行下列鉴定：
1．取1滴染液于乳白玻板上，自行迅速扩散开，其颜色变紫红色，且有伪足形成。
2．取1滴染液加1滴缓冲液，染液由深蓝色立即变为紫红色。
3．取血片或骨髓片进行试染检查，观察染色后各类细胞的胞核、胞浆及颗粒着色情况，pH是否合适及染色合适时间。如有上述变化，表明染液合格，可供使用。
（五）瑞氏染色(Wright's)-姬姆萨（Giemsa's）混合染色：
●瑞氏染色的染料配方浓度对细胞核着色程度适中,细胞核结构和色泽清晰艳丽,对核结构的识别较佳,但对胞浆着色偏酸,色泽偏红,对细胞浆内颗粒特别是嗜天青颗粒及嗜中性颗粒着色较差。
●姬姆萨染色对胞浆着色能较好的显示胞浆的嗜碱性程度,特别对嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰, 色泽纯正,而对胞核着色偏深,核结构显示较差。
●故采用以瑞氏染液为主，姬姆萨染液为辅的混合染色。
染色步骤:
1. 先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖；
2. 稍等片刻再加姬姆萨染液2-3滴加减(根据涂片上细胞多少及增升程度酌情而定)；
3. 稍等1-2分钟后,再加磷酸盐缓冲液,加时应缓慢地一滴一滴加在涂片膜上,直至膜面上染色液形成表面张力而终止染色液加入；
4. 染色30-40分钟；
5. 分色：用自来水缓缓冲洗至少3分钟以上,待干，勿用滤纸吸干,以免滤纸纤维污染涂片。
三．形态学与血液检查与自身特性
（一）血常规
（二）白细胞分类
（三）骨髓外周血细胞形态学及分类
（四）血细胞涂片特性
（一）血常规检查（Hb、RBC、WBC、PIT、血细胞比积、RBC-MCV、MCH、MCHC及血小板容积曲线）
●用自动化仪器提高工作效率，
●为使结果准确可靠，必须建立监测方法，搞好质控，此属数值质控。
●我国已较普遍开展全国、省、市（地区）质控。但普遍存在应付质控质量的问题，并未能切实解决自身质控问题。
（二）白细胞分类：
●白细胞分类的自动化已普遍应用，只能为患者普查与筛选之用。遇有问题应用显微镜观察，弥补自动化仪器缺陷。
●一般医院显微镜档次偏低，分辨率低，维修和正确使用欠缺，提高显微镜档次更好地发挥光镜的观察效应。
（三）骨髓及外周血细胞形态学及分类：
●是血液病临床诊断的依据及临床各科患者基本检查可反映原发性疾病的继发性血液学病理改变。
●临床血细胞形态学诊断检查的程序和内容应包括临床资料（血常规）初步诊断内容及血细胞形态学（骨髓外周血）。
●必要时还要做细胞化学染色骨髓组织病理学等检查的完整概念。
（四）血细胞涂片自身的特性：
1．涂片不易均匀：由于血液是混悬液，其中白细胞、RBC、血小板的形态大小、比重及生物活性和血浆成分等的不同和制片技术差异、细胞分布不均匀性差异颇大。
2．细胞分布与分类的非随机性：
● 细胞分类标准与观念不一；
● 采样和计数100~200个白细胞的局限性；
● 细胞分布的生理变动；
3. 与疾病的相关性；
4. 形态学质控：
●室内、室间分类不一致性，开展室间质控也是促进形态学质量稳定的一种手段。
●自1983年以来，澳大利亚皇家病理学质控中心和英国皇家进修学院WHO质控中心及最近美国洛杉矶质控中心，国内：全国及省地市也普遍开展，由质控标本涂片发展图片指定细胞识别。
●必须健全诊断报告审核制度、专业进修、讲习班、读片研讨会等学术交流，是提高形态学诊断质量的保障。
