Cas9脂质纳米粒可以作为一种高效的神经原代培养载体 二
的百分比GFP+神经元呈剂量依赖性，其中1 ug/mL的比例最高。
平均荧光强度(MFI)最高的GFP mRNA剂量1µg / mL,每个处理n = 3,单向方差分析与Dunnett多个比较测试,* * p < 0.005, p < 0.05
使用PrestoBlue®细胞活力试剂检测细胞活力。在使用任何剂量时均未观察到毒性，n=6为每个治疗的单因素方差分析(Dunnett’s multiple)比较测试
封装不同mRNA的纳米颗粒的尺寸和多分散性指数(PDI)具有可比性。GFP mRNA全长996个核苷酸，Cas9 mRNA全长4479个核苷酸长度。尽管使用不同长度的mRNA，但粒径和PDI没有显著差异,学生测试
质粒在大鼠原代神经元中的传递
MAP2阳性神经元(红色)经Neuro9 GFP处理后表达GFP(绿色)plasmid-LNP 5µg
/毫升ApoE的存在，细胞用抗map2一抗/alexa fluor-594偶联二抗和抗gfp一抗/alexa
fluor-488偶联二抗染色，核用DAPI染色(蓝色)
流式细胞仪分析在Neuro9 GFP plasmid-LNP存在下治疗48 h后的情况5µg
/毫升ApoE在鼠初级神经元,DIV 7,显示>
95%的神经元表现出lnp的吸收(用荧光探针计算，纳米颗粒内确实有包裹)用不同剂量的GFP质粒处理(数据未显示)
GFP neruons呈剂量依赖性，其中0.6ug/mL的比例最高。
在GFP MFI中也观察到这种剂量反应模式，n=3表示每次治疗的单因素方差分析Dunnett's多重比较检验，**** p<0.0001， ** p<0.005
使用PrestoBlue®细胞活力试剂检测细胞活力。任何剂量均未观察到毒性，每次治疗n=6，单因素方差分析与Dunnett’s倍数比较测试
包覆不同质粒的纳米颗粒大小和PDI具有可比性。尽管使用不同大小的质粒，颗粒大小和PDI没有显著差异，学生的t-test
质粒在体内的传递
10个月大的FVB小鼠，皮下注射GFP plasmid-LNP，48H后GFP表达(绿色)。注入5μl 3mg/ml GFP
plasmid-LNP。用DAPI染色(蓝色)细胞核，用DiD染色(红色)的LNP，GFP表达(绿色)在相同的区域上。LNP的摄取和GFP的表达均在注射区域内定位纹状体，并已扩散到包括心室部分在内的周围增生性区域系统和胼胝体。
小RNA在大鼠原代神经元中的传递
A)使用Neuro9 siRNA-LNP处理48 h后流式细胞术分析，5µg /毫升ApoE存在鼠主要神经元中,DIV 7,显示> 95%的神经元显示吸收的脂质纳米颗粒(使用荧光探针计算纳米颗粒内的包壳)
B)使用PrestoBlue®细胞活力试剂检测细胞活力。在有效剂量为5倍的情况下，未观察到毒性，采用单因素方差分析和 Dunnett’s 多重比较试验。
C) siRNA LNP剂量在1µg /ml的产品，同时使用IDT和Dharmacon的siRNAs，靶向mRNA75%击倒，每个处理n=3，与Dunnett的单因素方差分析多重比较检验，**** p<0.0005。
D) C) 封装不同siRNA的纳米颗粒的大小和PDI 比较，尽管使用不同大小的siRNAs，但颗粒大小和PDI没有显著差异。
结论
NanoAssembly™平台能够创建携带siRNA、mRNA或质粒有效载体高度可重现性的LNPs
这些LNPs在原代、大鼠、皮层神经元可以有效地传递（>95%），并且允许相关的payloads高效传递
即使在高剂量时，LNPs对这些初级神经元也没有毒性(50x)
我们的研究结果证实，这些脂质纳米粒可以作为一种CRISPR-Cas9组分到介导基因的有效的传递系统使用
LNP-mediated CRISPR-Cas9传递
LNPs具有多种功能，可以通过mRNA、pDNA或预先形成的核糖体蛋白复合物来传递Cas，一个或多个导向股也可以很好传递
实验仪器：
NanoAssemblrTMSpark纳米颗粒合成系统
NanoAssemblr Benchtop纳米颗粒合成系统
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