荧光偏振法快速准确高通量检测IgG和含Fc段衍生物
荧光偏振法快速、准确、高通量检测IgG和含Fc段衍生物
Dr. Carolanne Doherty
Valitacell, NIBRT, Fosters Avenue, Blackrock, Dublin, Ireland
BMG多功能酶标仪可应用于定量IgG的新技术Valita™TITER
采用荧光偏振法直接在细胞培养上清液中检测IgG
酶标仪预设检测程序和数据分析模板提高研究速度
简介
准确、快速和高通量检测IgG对于大多数治疗性抗体的开发和生产来说是必不可少的。单克隆抗体正在生物药物领域大显身手，大量的样本正等待着进行筛选以进一步得到开发。这里我们介绍一种在细胞培养上清中直接定量IgG的全新的筛选技术：Valita™TITER。
现有的技术，包括蛋白A高效液相色谱（HPLC protein A）、ELISA技术、 蛋白A表面干涉法以及HTRF（均相时间分辨荧光）都具有明显的缺点，包括价格昂贵、耗力以及耗时。
Valita™TITER方法是一种全新的非常精确、低成本的检测IgG的方案，检测范围在2.5-80mg/L。Valita™TITER采用荧光偏振技术检测IgG的Fc段与蛋白G的结合（图1）。分析在96孔板中进行，操作简单、高通量、快速且可自动化完成。分析可以在很少量的细胞培养基中进行且没有繁琐的准备过程。
在这个应用指引中，我们介绍了在PHERAstar®，POLARstar® Omega以及CLARIOstar®多功能酶标仪上使用Valita™TITER试剂盒定量检测IgG的方案。
图1：荧光偏振法定量测定IgG的Valita™TITER分析原理示意图。96孔Valita™TITER微孔板的每个孔中预先包被了标记了荧光的可与IgG结合的多肽-蛋白G（A）。IgG样本结合于多肽上并通过荧光偏振和弥散（去偏振）进行测定（B）。
图2：分析原理：分析利用荧光偏振法进行IgG定量。通过测定因分子旋转而产生荧光偏振来测定样本的浓度。小的、无结合分子在溶液中转动快，而大的、结合的分子转动慢。
荧光偏振可以有效地分析分子大小的改变。“不动”的荧光基团在偏振光的激发下会发出与激发光相同偏振方向的荧光。然而，转动的荧光基团的荧光偏振方向与激发光偏振方向相比会有一定的改变。在溶液中小分子比大分子转动更快，因此，连接有荧光基团的分子大小的改变，可以通过荧光去偏振程度的大小来进行测定。所以，当标记有荧光的蛋白G在没有结合其它分子时，其转动快，去偏振更多，而结合了IgG则相反（大5倍）（图2）。这种偏振的改变应用于检测溶液中的IgG。荧光偏振（FP）通过用平行偏振方向的激发光照射溶液并在平行方向和垂直方向上测定发射荧光。FP就是这两个偏振荧光的归一化后的差别，通常用mP表示。
材料和方法
Valita™TITER分析试剂盒
Valita™TITER APP软件（试剂盒里提供）
IgG标准品（从人血清中获得IgG）
PHERAstar, POLARstar Omega和CLARIOstar多功能酶标仪 (BMG LABTECH)
实验过程
样品的准备遵照试剂盒说明书的相应要求。标准曲线的绘制采用每个相对荧光值对应一个IgG标准品的方法。在Valta™TITER微孔板的每个孔中加入60µl重建缓冲液以及60µl标准品或样品。混匀后避光孵育30分钟。然后在POLARstar Omega、PHERAstar或CLARIOstar多功能酶标仪（BMG LABTECH公司）中，采用预置的检测程序进行读数（参数的设定详见下表）。在MARS分析软件中将获得的Raw Data转化成.csv格式文件，再用Valita™APP软件进行分析。
仪器设定
结果与讨论
图3的标准曲线（2.5-80mg/L）是在BMG LABTECH公司具有荧光偏振检测功能的多功能酶标仪（POLARstar Omega、CLARIOstar和PHERAstar）上用Valita™TITER试剂盒绘制的。所有酶标仪所获得的结果都具备很高的稳定性。
图3：在CLARIOstar多功能酶标仪上用Valita™TITER构建的IgG定量标准曲线。误差线表示3个复孔的标准差
最后，我们用不同条件培养的样品，用Valita™TITER定量IgG的结果与用常规方法HPLC的结果进行对比。图4显示两种方法测定结果的相关性，显示两种定量方法都有很好的准确性，而Valita™TITER分析速度更快因其不需要繁琐的样本准备过程。
图4：Valita™TITER定量IgG的结果与常规HPLC的结果进行对比
结论
在研发和生产此类生物药物中对混合样本进行快速IgG浓度测定非常重要。这里我们介绍了一种基于荧光偏振法的快速、简单的进行高通量IgG和Fc段衍生物测定全新技术——Valita™TITER分析法。Valita™TITER分析法可以直接对待测样本中的IgG进行定量测定而无需繁琐的样本准备或纯化过程。CLARIOstar， PHERAstar和POLARstar Omega应用于Valita™TITER分析时现实出卓越的性能。与其它IgG的定量方便相比，Valita™TITER具有高通量、简单、准确、快速的特点。
