CEX-RP-LCMS在线直联技术“仙人指路” ，为生物药蛋白电荷异构体杂质研究
“研究并明确生物药相关物质和杂质的种类、形成机制、影响因素，评估其对产品的作用或影响，并进行恰当合理的控制，是贯穿于整个生物药研发、生产周期中的重要工作。”【注】
电荷异质性是蛋白类药物的关键质量属性，电荷异构体可能来源于天冬酰胺脱酰胺、天冬氨酸异构化、琥珀酰亚胺形成、C端赖氨酸丢失、N端环化（焦谷氨酸形成）、唾液酸化和氧化等翻译后修饰，对重组蛋白类药物的稳定性、溶解性、免疫原性、体内外生物学活性和药物动力学功能发挥具有重要的影响。
阳离子交换色谱法（CEX）是研究蛋白类药物电荷异构体分析的关键技术。图1是蛋白类药物典型CEX图谱。对电荷异构体各峰进行鉴定，是药物深度表征研究的需求，也能够为研发中工艺开发提供技术支撑，指明优化的方向。
图1蛋白类药物典型CEX图谱
上海测简奕科技（以下简称“测简奕”）采用安捷伦在线二维液相色谱（图2所示），开发了在线2D-CEX-RP-LC QTOF MS方案，可以对CEX各电荷异构体峰做快速鉴定分析。目前，测简奕已为二十多家生物医药客户提供了CEX电荷异构体峰鉴定服务，项目数量超过50个，其中近20个已经进行IND申请。
图2 安捷伦在线2D-CEX-RP-LCMS系统
本文从以下四个方面阐述了做CEX峰“快速”鉴定的必要性和重要性：
为什么做CEX峰“快速”鉴定（Why）
哪些部门需要做CEX峰“快速”鉴定（Who）
什么时候做CEX峰“快速”鉴定（When）
怎么做CEX峰“快速”鉴定（How）
需要知道各峰形成的原因，满足药物申报深度表征的要求，或者为工艺优化指明方向；
离线收集各峰，再通过LCMS鉴定，花费的时间长，收集过程组分可能发生变化，需要快速地、更全面地对CEX峰进行分析；
CEX峰多，分离度不好，峰含量低，离线收集各峰难度大，需要高通量、高分辨率的方法。
质量研究和控制部门
工艺开发部门（细胞培养、纯化和制剂等）
药物申报时，需要对CEX峰做深度表征研究；
工艺开发过程，需要知道CEX峰的形成原因，从而明确工艺优化方向。采用”离线收集+鉴定“花费时间长，不能满足时效性要求；
离线收集不能准确鉴定峰的形成原因，需采用在线方式鉴定，以下两个案例均为这种情况
案例1：离线收集过程峰组分发生变化
案例1通过在线2D-CEX-RP-LCMS和离线CEX-RP-LCMS方案对图1中案例蛋白的碱性峰P6做了鉴定。通过在线2D-CEX-RP-LCMS检测，P6峰的主要分子量为148041Da，通过与蛋白主峰P3分子量（148058Da）比对，可以推测出P6主要是因为发生了天冬氨酸琥珀酰亚胺化形成的。而在离线收集P6后进行质谱分子量分析，得到分子量148057Da，与主峰P3没有差别，未见明显修饰峰148041Da；且从P6纯度验证的色谱图中可以看到，在收集的P6馏分中，P6已明显变为主峰P3和碱性峰P4。说明了P6在收集和浓缩处理的过程中已发生变化。主要原因是因为P6是天冬氨酸琥珀酰亚胺化形成的，天冬氨酸琥珀酰亚胺相对不稳定，在离线收集和浓缩过程中，变成了天冬氨酸和异天冬氨酸，即主峰P3和碱性峰P4.
图3 碱性峰P6的离线鉴定和在线鉴定结果
案例2：常用离线LC-MS鉴定方案难以确定形成原因
案例2通过在线2D-CEX-RP-LCMS对图1中案例蛋白的酸性峰P2做了鉴定。通过在线2D-CEX-RP-LCMS检测，P2峰的主要分子量为148671Da，通过与蛋白主峰P3分子量（148058Da）比对，可以推测出P2主要是因为发生了谷胱甘肽化形成的。而离线收集后进行质谱鉴定时，常用的样品处理通常会加二硫苏糖醇等还原剂，而还原剂会造成谷胱甘肽的丢失。若按常用操作，不能鉴定到谷胱甘肽修饰，造成结果的误判。
测简奕开发了在线2D-CEX-RP-LC QTOF MS方案，可以对CEX各电荷异构体峰做快速鉴定分析。方案的第一维是CEX，可以不改变客户CEX原有方法条件，保证CEX的图谱可以重现；CEX的各个峰组分通过阀切换捕集在收集环中，之后进入第二维RP-HPLC柱，经过除盐和分离后进入质谱MS检测。
通过在线2D-CEX-RP-LCMS方案对图1中的P1~P6做了快速鉴定，结果如下：
与“离线收集+LCMS鉴定”方案相比，在线2D-CEX-RP-LCMS方案做峰鉴定的时间大大缩短，可在1小时内完成一个峰的分析，且避免了离线收集可能引起的组分变化。另一方面，离线收集时，对于分离度不好的峰，通常会把相邻的几个峰一起收集，鉴定的结果是几个峰混合的结果，而在线鉴定可以收集很窄的范围，通常是各峰的“峰尖”，即使各峰分离度不好，也可以对各峰做各自的鉴定。
所以，CEX峰的鉴定，在工艺开发阶段需要对峰做快速分析，通常用在线2D-CEX-RP-LCMS直联方案就可以满足要求；在药物申报表征研究时，最好的方式是2D-CEX-RP-LCMS直联+离线收集后LCMS鉴定联合方案*，两种方案相互验证，对电荷异构体做全面表征。
*2D-CEX-RP-LCMS直联鉴定方案：主要是从分子量水平对峰进行鉴定；离线收集LCMS鉴定方案：如果需要进一步对修饰（脱酰胺化、氧化等）位点进行确认，CEX峰离线收集后可以从肽图水平进行分析。
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