浅谈食品中蛋白质测定方法的研究进展
蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的惟一来源, 具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转和遗传等密切相关, 其分离与定性、定量分析是生物化学和其他生物学科、食品检验、临床检验、诊断疾病、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。随着分析手段的不断进步, 对食品中蛋白质含量的测定方法也正向准确和快速的方向发展。
1 食品中蛋白质的检测方法
目前, 测定食品中蛋白质含量的方法有多种, 一般可分为间接方法和直接方法。间接方法是通过测定样品中蛋白质的含氮量进行推算蛋白质含量的方法; 直接方法则是根据蛋白质的物理和化学性质, 直接测定蛋白质含量的方法。多年来, 利用蛋白质的主要性质( 如含氮量、肽键、折射率等) 和蛋白质含有的特定氨基酸残基( 如芳香基、酸性基、碱性基等) 来测定蛋白质含量的方法不断发展, 主要有凯氏定氮法( 国际经典测定方法) 、分光光度法和滴定法等。所用到的仪器有凯氏定氮仪，也叫做蛋白质测定仪。
1.1 凯氏定氮法
测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法, 它是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一, 是被国内外作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定过程。在催化剂作用下, 试样用浓硫酸消煮破坏有机物, 使其中的蛋白质氮及其他有机氮转化为氨态氮, 然后与硫酸结合生成硫酸铵, 加入强碱进行蒸馏使氨逸出, 用硼酸吸收后, 再用酸滴定, 测出含氮量, 将结果乘以换算系数, 计算出粗蛋白质含量。然而该方法存在消化时间太长, 会产生有毒有害气体, 因此必须在通风橱中进行的弊端。宗留香等人对这一传统方法进行了改进, 即用Se 粉作催化剂进行消化, 不用通风橱, 即实现了环保消化, 并提高了消化效率。
1.2 光度法
光度法分为考马斯亮蓝G- 250 法、双缩脲法、Folin 酚法( Lowry 法) 、BCA 法和紫外吸收法。
1.2.1 考马斯亮蓝G- 250 法
考马斯亮蓝G- 250 与蛋白质结合反应十分迅速而且稳定, 反应2 min 左右即达到平衡, 其结合物可在室温下1 h 内保持稳定。考马斯亮蓝G- 250 法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法, 其最低蛋白质检测量可达1 μg, 比Folin 酚法的的灵敏度高约4 倍,这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质—染料复合物有更高的消光系数, 因而光吸收随蛋白质浓度的变化比Lowry 法要大得多。该法方法简便, 易于操作, 所用试剂较少, 显色剂易于配制; 干扰物质少, 如糖、缓冲液还原剂和络合剂等均不影响显色。
1.2.2 双缩脲法
双缩脲法对白蛋白、红蛋白产生的颜色反应相近, 不受温度影响, 可快速测定蛋白质含量, 但灵敏度低, 测定范围为1~20 mg 蛋白质, 适用于精度要求不高的蛋白质含量的测定, 常用于谷物蛋白质含量测定。三羟甲基氨基甲烷和一些氨基酸、EDTA 等会干扰该反应。李宁对凯氏定氮法、考马斯亮蓝法和双缩脲法进行了比较, 得出结论为, 凯氏定氮法、双缩脲法和考马斯亮蓝染色法都可以测出被测的全部5 种样品的蛋白质含量, 其中凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法, 是一种蛋白质测定的经典方法,适用样品广泛和用于结果要求准确的测试; 双缩脲法和考马斯亮蓝染色法的测试过程简便、迅速, 用于可以准确配取标准蛋白溶液而准确性要求不高的测试中。可以根据含氮量的不同选择以上两种方法。
1.2.3 Folin 酚法
Folin 酚法是双缩脲法的发展, 它结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应。Folin 酚法广泛应用于水溶性蛋白质含量的测定。Folin 酚法的灵敏度比双缩脲法高100 倍, 肽键显色效果增强, 减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法由于两步呈色反应可以叠加, 其灵敏度特别高, 所以适用于20~250 μg 微量蛋白质的测定, 可检测的最低蛋白质量为5 μg。
1.2.4 BCA 法
BCA 蛋白质检测试剂是当前比Lowry 法更优越的专用于检测总蛋白质含量的产品, 该法快速灵敏、稳定、可靠, 且对不同种类蛋白质的变异系数甚小, 可检测到的蛋白质量为0.5 μg, 是目前已知的最灵敏的蛋白质检测试剂之一。
1.2.5 紫外吸收法
紫外吸收法简便、灵敏、快速, 不消耗样品, 低浓度盐类不干扰其测定。该法的缺点是测定与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质时, 有一定的误差。紫外吸收法适用于测试无色样品, 对于有色样品, 需进行预处理, 排除颜色干扰后才适用于此方法。另外核酸在紫外区也有强吸收, 但通过校正可以消除。
在蛋白质测定中, 光度法应用最多, 适用较广,对该类方法的研究较深入并不断被发展。有机染料结合分光光度法测定蛋白质, 操作简便, 比较灵敏, 一般实验室条件均能满足检测要求,近年来国内外对该类方法的研究应用备加重视。该类方法的基本原理是在酸性介质中, 蛋白质的肽键和N端氨基质子化成阳离子, 由于电荷作用, 蛋白质与阴离子染料结合沉淀或改变结合染料的光吸收特性, 由染料颜色的减退或变化的程度来测定蛋白质的含量。考马斯亮蓝G- 250 染料已被广泛应用; 橙红G、溴甲酚绿、埃铬青R、溴酚蓝、酸性品红等染料也已被用于蛋白质测定; 偶氮胂K、偶氮胂Ⅲ、偶氮胂M、硝基磺酚C、硝基磺酚S、氯磺酚K、氯磺酚S、茜红素S、变色酸2C、变色酸2B、曙红Y等染料测定蛋白质的分光光度法研 究均有报道。
近几年利用金属离子和有机染料形成配合物体系, 结合光度法测定蛋白质含量的方法得到了发展。金属离子与含有- OH 或C=O 的有机染料相遇时, 氧原子中的孤对电子可顺利进入杂化轨道, 形成稳定的配合体系, 在酸性条件下, 该体系遇到结构不对称的蛋白质分子时, 互相极化产生静电作用而组合成新的大分子团, 改变了原体系的广谱性能, 从而能定量测定蛋白质的含量。此类方法具有灵敏度高, 线性范围广, 干扰离子少, 操作简单、快速及适于常规应用等特点。金属离子—有机染料结合分光光度法测定蛋白质含量的发展很快, 如Cu ( II- 氯磺酚S 配合物、Cu ( II) —偶氮胂K 等。荧光光度法用于蛋白质定量测定是近年逐渐兴起的新方法, 利用反应物的荧光强度随蛋白浓度的增加而增加的现象进行蛋白质测定, 并具有工作曲线的线性范围窄和检出限高的特点。用于荧光光度法的试剂有吖啶橙、茜红素S、曙红Y 和灿烂甲酚蓝等。
1.3 滴定法
1.3.1 甲醛滴定法( 指示剂滴定法)
该法节省试剂, 分析速度快, 操作简便易行。刘玉兰等人分别用甲醛滴定法和凯氏定氮法测定棉籽饼、大豆、花生、小麦、玉米和蚕豆等蛋白质含量,结果基本一致, 偏差小于0.20。
1.3.2 pH 滴定法
pH 滴定法是指酸碱滴定至某一指定pH 值时,根据滴定剂用量和有关公式计算被测物浓度或含量的方法。它是在水溶液中直接滴定极弱酸碱的最新方法。该方法必须确定合适的pH 值。张大伦等人以玻璃电极为指示电极, 饱和甘汞电极为参比电极, 测定了大豆和花生的蛋白质含量, 结果与传统凯氏定氮法的测定结果相一致。
1.3.3 甲醛改进滴定法
马美范和黄晓东将甲醛滴定法和pH 滴定法相结合, 根据甲醛法的原理, 以pH 计替代指示剂指示滴定终点。当铵离子与甲醛迅速反应时放出同物质量的酸, 生成的酸用氢氧化钠标准溶液滴定, 用电位滴定计指示化学计量点, 根据消耗的氢氧化钠标准溶液用量计算出蛋白质含量。运用该法测定蛋白质时,待测液必须是中性, 中和时必须严格控制溶液的pH 值, 以免铵盐分解引起误差。HCHO 可被空气氧化为甲酸, 宜临用前配制。该法所获结果与凯氏定氮法无显著差异。
2 结束语
以上几种蛋白质常用的测定方法中, 最经典的是凯氏定氮法, 但是这种方法需要自动或半自动的凯氏定氮仪, 这些仪器价格比较昂贵, 且需要专门的试剂, 因此较难普及。现在已有一些学者对其进行改进研究。在科研检测工作中, 用户可根据具体情况选用适宜的、较常用的这些测定蛋白的方法。
