Lowry 检测法测定蛋白质浓度实验
Lowry检测法
| 实验方法原理 |
Lowry 法又称为 Folin-酚试剂法。首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂 （Folin-酚上级），产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色 的复合物在745～750 nm 处有最大的吸收峰，颜色的深浅（吸收值）与蛋白质浓度成正比，可根据 750nm 的光吸收值大小计算蛋白质的含量。 |
|---|---|
| 实验材料 | 待测蛋白质样品 |
| 试剂、试剂盒 | 五水硫酸铜 柠檬酸 碳酸钠 NaOH Folin-酚试剂 |
| 仪器、耗材 | 分光光度计 比色杯 移液管 枪头和加样枪 试管（3～5 ml） 试管架 震荡器 |
| 实验步骤 |
1. 溶液 1.1 溶液 A，100 ml 0.5 g CUSO4·5H2O 1 g Na3C6H5O7（·2H2O） 加双蒸水至 100 ml， 溶液可长期保存于室温。 1.2 溶液 B，1L 20 g Na2CO3 4 g NaOH 加双蒸水至 1 L， 溶液可长期保存于室温。 1.3 溶液 C，51 ml Folin 溶液A 50 ml 溶液B 1.4 溶液 D，20 ml 10 ml Folin-酚试剂 10 ml 双蒸水 2. 检测 2.1 用双蒸水稀释样品至 0.5 ml； 2.2 加 2.5 ml 溶液 C； 2.3 混匀在室温下放置 5～10 min； 2.4 加 0.25 ml 溶液 D， 混匀； 2.5 20～30 min 后，在分光光度计上测 A750 值。 3. 从干扰物质中纯化蛋白质样品的附加步骤 脱氧胆酸-三氯醋酸（DOC-TCA）沉淀法。此法可在测定蛋白质的溶液浓度低于 1 ug/ml 情况下使用。 所需试剂：0.15 ％ （w/V）DOC：72 ％ TCA 3.1 于 1 ml 蛋白质样品中加入 0.1ml 0.15 ％ DOC； 3.2 震荡后在室温放置 10 min； 3.3 加入 0.1 ml 72 ％ TCA， 摇匀后，1000～3000×g 离心 5～30 min。如使用固定角转头，以及低温或大体积则需较长时间离心； 3.4 倾斜，吸弃上清液； 3.5 直接用溶液 C 溶解沉淀。
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| 注意事项 |
1. 在加入试剂 20～30 min 后呈色达到饱和，此后每小时颜色信号减弱 1 ％。 2. 许多干扰物质降低颜色反应，而去垢剂引起颜色轻微升高。 3. 高浓度盐可引起沉淀。 4. 氯仿抽提可去除溶液中的脂质，在 K＋ 或 Triton X-100 存在时可通过离心去除混浊物。 5. 去垢剂，蔗糖和 EDTA 的干扰可通过在 Lowry 试剂中加入 SDS 来消除。 6. —般情况下，蛋白质-染料复合物的消光系数 ≤ 1.2。
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