过氧化氢酶的测定实验
基本方案
实验方法原理 |
H2O2:H2O2 氧化还原酶。 H2O2 →O2 + H2O 这个绿色的酶有四个相同的亚基组成(Mr=60 000), 每一个亚基携带一个正铁血红素 IX 基团,这个基团处于高速旋转状态,核心是一个三价的铁。铁离子的四个配位位点被卟啉结构占据,第五个位点被蛋白质的组氨酸得到。第六个位点保持自由状态,但也有可能被氰化物或者氟化物这样的阴离子占据,并阻碍酶反应。氰化物结合后会减少铁移入卟啉环平面,高速旋转状态变为低速旋转状态,同时伴随着一种很大的光谱移动(回顾请查阅 Nicholls 和 Schonbaum,1963)。过氧化氢酶是被 Sumner(1937) 最早结晶的酶之一,并且由于它髙度的结晶倾向性,晶体悬浮液是首选的储存形式。酶底物的过氧化氢会在高浓度的时候破坏酶。因此,酶实验不能发生在底物饱和的环境下,而且 Km 也不能直接被动力学分析确定。在 405 nm 处酶的吸收系数为 38×103 l/(mmol·mm)[9.5 l/(mmol·mm)每血红素基团]。 |
---|---|
实验材料 | 酶样品 |
试剂、试剂盒 | H2O2 磷酸钾 |
仪器、耗材 | 分光光度计 |
实验步骤 |
实验所需「试剂」具体见「其他」 0.98 ml H2O2 溶液 0.02 ml 酶样品(浓缩的原料用 0.05 mol/L 磷酸钾溶液 pH 7.0 稀释大约 2000 倍) 25℃ 在比色皿中测量的吸收值于 240 nm 处降低;ε240=4.0 l/(mmol·mm)。每分钟吸收值变化 0.04 相当于每分钟分解 1 umol H2O2,约 1 IU,约 16.67 nkat。
|
注意事项 | |
其他 |
试剂: 0.05 mol/L 磷酸钾,pH 7.0 H2O2 溶液(约 10 mmol/L):0.06 ml 30% H2O2 稀释于 50 ml 0.05 mol/L 磷酸钾 pH 7.0 中,在 240 nm 处以缓冲液为对照的吸收值应该是 0.50±0.01.否则要用缓冲液或者 H2O2 调节这个值。 |