技术强则药物强-单个B细胞抗体制备技术
如今,单克隆抗体药物以其独特的作用机制及高效性,在肿瘤和自身免疫疾病的治疗中发挥了不可估量的作用,成为全球的研发热点，目前已有2400个单克隆抗体药物处于研发及商业化阶段。
1975年杂交瘤技术问世[1]。1986年鼠源单克隆抗体药物Muromonab的上市拉开了单克隆抗体发展的序幕。随后的50年，单克隆抗体药物经历了嵌合抗体-人源化抗体--全人源抗体四个阶段，产生了抗体偶联药物、抗体融合蛋白、单域抗体等多种新型抗体药物，标志着免疫疗法黄金时代的开启[2]。单克隆抗体药物的推陈出新归根于单克隆抗体技术的不断发展与创新。目前应用的抗体技术有：杂交瘤技术、噬菌体展示技术、天然全人源库技术和单个B细胞技术。
单个B细胞抗体制备技术原理
单个B细胞技术[3]是近年来新发展的一类快速制备单克隆抗体的技术，是根据每一个B细胞只含有一个功能性重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序列，以及每一个B细胞只产生一种特异性抗体的特性，从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性B细胞，通过单细胞PCR技术从单个抗体分泌B细胞中扩增IgG重链和轻链可变区基因，然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。这种方法保留了重链和轻链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效率高、全天然源性的特点，也成为了目前快速开发针对抗病毒感染性疾病抗体的重要策略。
单个B细胞抗体制备过程
图1 单个B淋巴细胞抗体制备过程[4]
1. 鉴定和分离单个B细胞
1）溶血斑块技术分选B细胞
溶血斑块技术原理[5]是抗原与抗体反应后，在补体作用下能使红细胞裂解形成溶血斑块，进而通过显微技术筛选和分离抗原特异性B细胞。该方法有点：方便、快捷、特异性好；缺点：红细胞容易受到温度、渗透压、酶等多方面影响，且溶血斑块技术分离的B细胞往往不能进行高通量分析和活细胞增殖。
图2 克隆单细胞免疫球蛋白VH和VLcDNAs产生特异性抗体的策略[5]
2）MACS法（磁珠分选法)分选B细胞
原理是基于抗原抗体结合的特异性，B细胞表面分子与包被有特异性抗体的磁珠相结合，形成表面分子-抗体-磁珠复合物，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，不能与特异性抗体相结合的细胞由于没有吸附磁珠，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离[6]。该方法优点：操作简单、稳定、重复性好；缺点：用到的抗体种类较多、对磁珠与磁珠柱的质量要求较高、费用较高。该方法可以和其它分离方法配合使用。
图3 磁珠分选法原理图[6]
3）微雕刻和ISAAC方法分选B细胞
微雕刻技术原理[7]是基于软光刻微阵列芯片识别、克隆抗原特异性B细胞的方法。通过刺激多克隆B细胞，并将其逐个分布到芯片孔内进行培养产生抗体，然后将改芯片孔内抗体转印至相应的蛋白芯片，通过与目标抗原反应后，再与荧光抗体反应，最后根据荧光抗体染色结果，通过显微操作将分泌特异性抗体的B细胞转移到细胞培养皿中进行后续克隆操作或抗体基因扩增。ISAAC(芯片免疫斑点微阵列测定)[8]，是微雕法的延伸，是用包被于芯片表面的抗IgG抗体替代了抗体转移过程，并且能在同一块芯片上研究针对多种不同目标抗原的特异性抗体，并分离多种抗原特异性B细胞。这两种方法优点：高通量、高特异性、高灵敏度；缺点：芯片阵列的构建价格较高、芯片上抗体包被比较复杂。
图4 ISAAC技术检测单个抗体分泌细胞[8]
4）FACS法分选B细胞
FACS法原理[9]是基于抗原抗体的特异性反应，利用荧光素标记的B细胞表面分子的抗体，以及标记的特异性抗原，通过多色流式分析与分选的方法，筛选抗原特异性B细胞。FACS分选可以将单个抗原特异性B细胞分选入细胞培养板的单孔中，直接进行抗体基因的扩增与测定。该技术是目前应用较广泛的一种方法。优点：分离B细胞快速、准确、大量、多参数同时分析；缺点：费用高、通电磁场对细胞有一定损伤，会影响细胞活性。
图5 FACS原理示意图[9]
(A) 传感器的流体力学聚焦和振动产生的液流断裂成液滴，其含有已被荧光标记抗体染色的细胞。(B) 通过激光扫描液滴，并对信号进行处理以给出“分类决策”（如果液滴含有绿色荧光细胞，则将进行充电并相应分类）。(C)当液滴脱落时，施加电荷。(D) 含有目标细胞的带电液滴由静电场引导进入指定的收集管完成分类。
5）微流控技术分选B细胞
结合微流控设备和芯片的技术是目前主流的商业化单B细胞平台。BLI公司（Berkeley Lights，Inc）的Beacon单细胞光导系统受到多家大型药企的青睐。Beacon平台是通过微流控系统将分泌抗原特异性抗体的细胞输送到芯片部位，并通过光电定位技术OEP将单细胞分离到芯片的各个小室中。而后采用基于磁珠的双色荧光结合实验检各细胞的分泌物，分泌抗原特异性抗体的细胞会产生荧光信号，被仪器识别，单个阳性细胞通过OEP技术被导出输送到96孔板中，进行进一步的测序、表达。该系统集单细胞分选和检测及分析为一体，灵敏度和准确度高。
图6 Beacon单细胞光导系统
2. 扩增和克隆抗体基因
通常通过FACS法分离抗原特异性B细胞后，将其分选至含裂解液的96孔板中，裂解B细胞并释放细胞内RNA。随后通过RT-PCR、巢式PCR得到抗原特异性单个B细胞抗体可变区基因。
3. 表达、筛选和鉴定抗原特异性抗体
FACS分选的单个B细胞抗体基因扩增、载体构建、抗体表达及活性验证是必要步骤。表达系统常用的是原核表达系统（例如大肠杆菌）或真核表达系统。在大肠杆菌中，通常表达抗体的抗原结合片段（Fab),而在哺乳动物中，可以表达完整的IgG分子。抗体生物活性验证主要通过ELISA、间接免疫荧光、中和试验等常规方法来验证；除此之外，还可以通过流式分析法、免疫共沉淀、空斑法、空斑减少中和试验等方法来验证。
单个B细胞抗体制备技术应用
单个 B 细胞抗体技术制备的单克隆抗体在抗病毒治疗、神经性疾病治疗、免疫疾病治疗等方面显出了独特的优势和良好的应用前景。
1. 抗病毒治疗应用
许多单B细胞抗体对病毒的治疗正在临床试验阶段中。HIV引起获得性免疫缺陷综合征，全球已有6390万人感染，通过单B细胞技术已获得5种抗HIV包膜蛋白的抗体(3BNC117； 10-1074； VRC01； PGT121；N6)正在临床I/II 期实验中进行评价。利用单个B细胞抗体技术，从治愈后的患者血液中分选抗体分泌的单个B细胞，快速鉴定和表达抗体基因，特别是对于新型病毒的治疗和预防有很大帮助。
2. 神经性疾病治疗应用
偏头痛是全球第三大最常见疾病和第六大致残性疾病，这是一种常见的慢性神经血管性疾病。2020年2月21日，Lundbeck宣布其偏头疼药物Vyepti（eptinezumab，兔抗体药物）获得美国FDA批准上市。Vyepti是由单B细胞技术制备的兔抗体药物，靶向结合降钙素相关基因肽（CGRP）配体，阻断其对受体的结合作用。其II期临床结果显示许多患者的偏头痛天数可以减少75%。此外，该公司的另一种偏头疼药物ALD1910正处于临床前研究阶段。
3. 免疫疾病治疗应用
单个 B 细胞抗体制备技术能够分离到人体内任意时期的B细胞，使得详细深入地研究人体免疫系统各个阶段功能和机理成为可能。对于自身免疫性疾病和其他免疫系统疾病治疗抗体研究有良好的应用前景。
虽然，单个B细胞抗体制备技术具有效率高、全人源、基因多样性更丰富等优势。但2020年之前的10年中FDA尚未批准任何该方法制备的抗体药物，且仍有一些不足，还有要不断克服和完善。全人抗体开发成为近期药物开发的趋势，多种抗体技术的结合也将产生更多有效药物，在医药领域极具前景。
百奥赛图新药研发平台
百奥赛图引入Beacon®单细胞光导系统，将分离和鉴定产生抗体的原代B细胞的工作在不到一天的时间内完成，结合自主开发的全人抗体RenMab小鼠，能够快速高效获得全人抗体，建立一站式抗体药物开发平台。百奥赛图将通过“千鼠万抗”计划,打造全球创新药物发源地，助力合作伙伴加快药物研发进程。
图 7 百奥赛图RenMab小鼠+Beacon平台加速抗体发现过程
参考文献
[1] Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J]. Nature, 1975, 256(5517):495-497.
[2] 高倩, 江洪, 叶茂, 等. 全球单克隆抗体药物研发现状及发展趋势[J]. 中国生物工程杂志, 2019(3):111-119.
[3] 向军俭, 童吉宇, 王宏. 抗体技术研究进展(1):人源抗体技术[J]. 暨南大学学报:自然科学与医学版, 2012(05):92-98.
[4] 吕信萍, 吴静, 陈京涛. 单个B细胞抗体制备技术及其在肝脏疾病中的应用[J]. 临床肝胆病杂志, 2015, 31(12):2104-2109.
[5] Babcook J.S., Leslie K.B., Olsen O.A., et al. A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes. [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996，93(15):7843-7848.
[6] Bosio A., Huppert V., Donath S., et al. Isolation and Enrichment of Stem Cells. Engineering of Stem Cells, [J]. advances in biochemical engineering/biotechnology, 2009, 114(114):23.
[7] Love J.C., Ronan J.L., Grotenbreg G.M., et al. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies[J]. Nature Biotechnology, 2006, 24(6):703-707.
[8] Jin A., Ozawa T., Tajiri K., et al. A rapid and efficient single-cell manipulation method for screening antigen-specific antibody–secreting cells from human peripheral blood[J]. Nature Medicine, 2009, 15(9):1088-1092.
[9] Fitzgerald V., Leonard P., et al. Single cell screening approaches for antibody discovery[J]. Methods, 2016(1-9).
[10] 迟象阳, 于常明，陈薇. 单个B细胞抗体制备技术及应用[J]. 生物工程学报, 2012, 28(6):651-660.
[11] http://commercial.dxy.cn/article/680978?trace=hot
