中科院：海洋生物cDNA分析
造礁石珊瑚为珊瑚礁生态系统中的框架生物, 研究其重要功能基因对于理解造礁石珊瑚对环境变化的响应有重要指示意义，近期来自中国科学院南海海洋研究所的研究人员提取了澄黄滨珊瑚(Porites lutea)的总RNA, 通过RT-RCR得到 cDNA, 并以 cDNA为模板设计引物进行 test PCR, 获得大小为 254 bp的 ferritin基因cDNA序列，并由此展开了分析研究。
珊瑚礁生态系统具有极高的生物多样性, 且对环境变化的响应极其灵敏, 其主要框架生物造礁石珊瑚属于刺胞动物门。近年来, 随着基因组学和蛋白质组学在造礁石珊瑚研究中的应用, 越来越多的学者开始从基因的角度来研究造礁石珊瑚。
在生物有机体中, 铁是参与细胞代谢所必需的微量元素之一。铁蛋白(ferritin)是广泛存在于动物、植物和微生物体内的一种铁储存和生物矿化蛋白。铁蛋白的表达水平很高, 而且其表达调控在维持机体铁平衡中发挥着重要作用, 其结构在所有脊椎动物中高度保守。通常情况下, 一个铁蛋白含 24 个不同比例的重型(H)和轻型(L)链亚基围绕着中央腔以存储铁离子。H 和 L 亚基是由不同的基因编码的, 它们在铁蛋白质复合体中扮演着不同的角色。H 亚基凭借其亚铁氧化酶的活性, 促进二价铁向三价铁转换, 然后形成一个 ferric-oxyhydroxyphosphate 复合物, 而L亚基则协助铁进入中央腔以及支持铁蛋白复合物结构的稳定。
铁蛋白高度保守的结构、生化特性和分布的广泛性突出了它在生物体中的重要性, 然而, 珊瑚 ferritin 基因的相关研究较少,因而, 研究珊瑚 ferritin 基因在珊瑚发育过程、环境胁迫下的表达可提供非常有价值的信息。造礁石珊瑚内参基因的选择也非常重要, 它们的表达量需要保持稳定, 对它们的功能和可变性进行研究, 不仅有利于发现变化显著的基因和发展新的标记基因, 还能为后来者的研究提供很好的基础。
近年来, 三亚鹿回头海域珊瑚礁衰退严重, 澄黄滨珊瑚是该海域的优势种之一。澄黄滨珊瑚对热带海洋环境有指示作用, 特别是其发育过程中一些重要功能基因的表达变化更是珊瑚分子生物学研究的重点, 功能基因表达变化与环境间的关系还有待研究，所以, 发展澄黄滨珊瑚功能基因作为指示环境变化和发育情况的标记基因非常重要。
在这篇文章中，研究人员提取了澄黄滨珊瑚(Porites lutea)的总RNA, 通过RT-RCR得到 cDNA, 并以 cDNA为模板设计引物进行 test PCR, 获得大小为 254 bp的 ferritin基因cDNA序列。
分析表明, 该部分序列编码了84个氨基酸, 其中包含一个亚铁氧化酶活性功能区, 而该活性功能区又有一个铁离子通道, 其与多孔鹿角珊瑚(Acropora millepora)的 ferritin基因相似度较高, 达 85%, 覆盖度为 100%, 推测该基因序列在种内和种间都较保守, 已向GenBank 提交序列, 并获得登录号为 JQ305796. 该序列可用于实时定量 PCR 技术(qRT-PCR)及 cDNA末端快速扩增技术(RACE)等后续分子生物学研究。
珊瑚ferritin 基因是与珊瑚发育及珊瑚白化相关的重要功能基因, 研究表明, H 型 ferritin 在珊瑚发育各个时期的表达情况变化明显, 在珊瑚的发育过程中发挥着重要作用, 而且 ferritin 基因还有抗氧化功能, 在珊瑚受到环境压力时能发挥抗氧化作用。在哺乳动物、鱼类和虾类中, 铁蛋白的表达可受病原体的刺激下的诱导, 表明它参与了其中的免疫反应, 迄今为止, 还没有学者对铁蛋白在珊瑚被病原体感染情况下, 其表达量的变化进行调查。本研究成功获得澄黄滨珊瑚 ferritin 基因的部分序列, 对于用来作为监测环境变化对珊瑚影响的生物标记研究奠定了重要的基础。
然而, 当前关于珊瑚 ferritin 基因表达差异的研究很少, 应当用 qRT-PCR 技术研究其在各个发育阶段或环境胁迫下的表达情况, 再利用 RACE 等技术获得该功能基因的全长, 进而研究其蛋白的结构和功能. 此外, 应该分析获得理想的内参基因来提高qRT-PCR 的效率, 但找到一个有效的内参基因也不是一项简单的工作, 大量的研究表明在不同生物个体及不同条件下, 一些常常被认为很保守的基因表达会时常变化. 对于一些共生生物如造礁石珊瑚, 虫黄藻可能会干扰珊瑚基因表达的检测, 所以选取的内参基因都应该只是在珊瑚中特异表达。
差异显示反转录-PCR (DDRT-PCR)就有利于发展识别一些合适的内参基因, 该方法能很方便地检测内参基因表达量的变化, 还能对它们的功能和可变性进行研究，在珊瑚基因表达研究中应用到的内参基因主要有 18S rRNA, 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和 β-肌动蛋白(β-actin)等, 而哪个更加适合做珊瑚的内参基因尚不可知。
