cDNA第二链的合成方法
cDNA第二链的合成方法有以下几种：
（1）自身引导法。合成的单链eDNA3’端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物。当第一链合成反应产物的DNA—RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段或反转录酶合成eDNA第二链，最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环，即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA5’端序列出现缺失和重排，因而该方法很少使用。
cDNA合成
（2）置换合成法。该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的DNA RNA杂交链不用碱变性，而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。
从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物。在大肠杆菌DNA聚合酶工的作用下合成第二链。
该反应有3个主要优点：①非常有效；②直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化；③不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。
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