重组G蛋白偶联受体的纯化实验（一）
一、引言
天然的整合膜蛋白的量并不充足。因此对其的结构测定和功能分析需要:①重组膜蛋白的生产系统;②能分离得到有活性的膜蛋白（而不是没有功能、折叠错误的膜蛋白）的纯化策略。表达并纯化原核和真核的膜蛋白在文献中都有报道。读者可以参考如Grisshammer 和Tate(1995;2003) 及Grisshammer和Buchanan(2006) 的文献，也可以查询本书的第35章。GPCR作为真核生物的整合膜蛋白，参与细胞间的交流和感觉信号转导[见Gether和Kobilka(l998)]。本章是对GPCR 的专题讨论。
对于如GPCR 的整合膜蛋白，本章不涉及其表达的所有可能策略细节，但是这里总结了一些关键点。①目前还没有一个通用的可高效表达功能受体的策略。一些GPCR能高水平的积聚在细胞膜上，而其他某些相关的受体却很难检测到。而且虽然推测具有相似性，但在特定的表达宿主中的不同的 GPCR表现却十分不同。所以GPCR 的重组表达仍然是一个反复实验的过程。例如，在表达对比研究中，已经完成的尝试包括使用甲醇营养型毕赤酵母(Andreetal.,2006)、杆状病毒昆虫细胞系统(Akermounetal_，2005) 和西门利克森林病毒系统（Hassaineetal.,2006)等。目前已经有了GPCR 在常用表达宿主表达的研究总结(Sarranmegnaetal.,2003)。②通常真核宿主似乎能够比原核宿主更好的表达有功能的、嵌膜的 GPCR(Grisshammer，2006)。但有一些例外。例如，已经在大肠杆菌中成功表达了神经降压素受体 NTSl(Grisshammeretal.,1993;Whiteetal.，2004)、M1蕈毒碱乙酰胆碱受体（HulmeandCurtis,1988)、腺苷A2a受体（WeiBandGrisshammer，2002) 和大麻素CB2受体632(Calandraetal.,1997;Yeliseevetal.，2005)。③已经有了很多关于重组表达整合膜蛋白的描述性报道。然而，目前只有少数文献[见 Bonander 等 (2005;2009),Griffith等（2003);Wagner等（2006;2007)]讨论了特定宿主细胞对于膜蛋白过表达的反应机制。
纯化受体从概念上可以分成两步: 第一步用合适的去污剂将受体从膜中提取出来 (增溶）; 第二步使用如常规的亲和标签、与该受体特异结合的配体层析柱、分子排阻色谱和其他方法纯化受体。最重要的是，必须注意选择实验条件以保持膜蛋白在整个纯化过程中处于活性状态。这一点怎么强调也不过分，因为很多 GPCR—旦被去污剂从质膜中提取出来就会变得不稳定。
二、蛋白质增溶的一般注意事项
提取嵌膜受体需要使用去污剂(详见第34章）。去污剂的正确选择对于长时间维持溶解受体的活性状态非常关键。]V-十二烷基子1>麦芽苷（iV-Dodecyl-^^maltoside，DDM) 是温和的非离子型去污剂，通常用于 GPCR 的增溶。添加脂样的胆留醇半琥珀酸酯 (CholesteryIhemisuccimte) 可以提高受体的稳定性。短链的去污剂通常要比长链去污剂作用猛烈，但只要它们不损害要研究的GPCR 的完整性, 也是可以接受的。
溶解的受体必须被看成是去污剂-脂质-受体的复合物，而不是单纯的受体蛋白质。
这意味着溶解后的受体的生化特性，如大小、形状或等电点与单独根据氨基酸序列计算出的结果是不一样的。同样，去污剂-脂质-受体的复合物不能被理所当然的当成是均质的。
因为在增溶过程中脂质与受体一样结合去污剂，因此去污剂和膜的比例会决定受体周围去污剂和脂质结合的量。在纯化的过程中脂质和去污剂的结合量会发生改变。
增溶的过程必须优化，使其能够在维持溶液中特定 GPCR 最稳定的同时得到最高的提取效率。通过放射性配体结合分析和总蛋白质含量测定，可以监测去污剂对加人的膜的系统变异 (systematicvariation) 效应。这需要计算实验的 Bmax 值（nmol 功能性受体/mg 蛋白质) 并将其与纯化的功能性受体的特异性结合的理论值相比较。如果没有可用的功能性检验方法，则可以使用具有良好生化行为的如对称的分子排阻层析谱作为受体完整性的指标。
因为在受体提取前可溶蛋白质已被去除，增溶之前的膜制备过程其实已经包含了一步初始的纯化步骤，目的受体对污染物的比例也会因此提高。实际上在第一步纯化过程中，受体也可从总细胞裂解物中而不是从溶解的细胞膜中富集。
三、蛋白质纯化的一般注意事项
1.去污剂溶液中 GPCR的稳定性
很多GPCR 在去污剂溶液中都不是十分稳定 [除了视紫红质 (rhodopsin)，只要其保持在非信号黑暗状态（DeGrip，1982)]。导致不稳定的一个可能原因也许是 GPCR 结构上固有的柔性，即受体在去污剂溶液中具有多种构象, 而其中的一些构象会使蛋白质聚集。在纯化过程中去除脂质也会引起不稳定。已经有很多方法用于提高 GPCR在去污剂溶液中的稳定性。例如，加入反向激动剂（inverseagonist)/抬抗剂（antagonist) 配体 (Cherezovetal.,2007；Hansonetal.,2008；Jaakolaetal.,2008；Warneetal.,2008)^使受体处于无信号失活状态, 这通常比活性状态更稳定 [见 Kobilka 和 DeUpi(2007)], 如胆甾醇半號 50 酸酯（cholesterylhemisuccinate) 的脂质或脂样物质 (Jaakolaetal.,2008;”TuckerandGrisshammer,1996;WeiBandGrisshammer,2002) 和甘油（TuckerandGrisshammer，1996) 在纯化中会提高受体的稳定性。定点突变也已经用于产生稳定性更高的GPCR(Magnanietal.,2008；Rothetal.,2008；Sarkaretal.,2008；Serrano-Vegaetal.,2008;Shibataetal.,2009), 因而能耐受更大范围的去污剂。
2.一般的亲和层析
去污剂溶液中 GPCR的生化和药理性质可以粗略地分为两类。①由放射性配体结合分析和 G 蛋白核苷酸交换实验 (Whiteetal.,2007) 评价，在优化的缓冲条件下, 能够纯化到活性形式的均质受体被称为功能性受体。②在某些情况下（Kobilka，1995;Whiteetal.，2004)，存在去污剂可溶的却不能结合特异性配体的受体种类。笔者把后一种称为非功能性的、未正确折叠 (至少在受体识别方面) 但仍是去污剂可溶的受体种类。
重组克隆技术使得在给定受体的 N 端或 C 端引入常用的亲和标签变得容易。例如，受体 N 端的 Flag 表位标签可用于 Ml 抗体亲和层析柱 (Kobilka,1995) 或受体 C 端的多聚组氨酸尾用于固定金属亲和层析（immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)(GrisshammerandTucker,1997；Hansonetal.,2008；HulmeandCurtis,1998；Jaakolaetal.,2008；Klaassenetal.,1999；Kobilka,1995；Warneetal.,2003；WeiBandGrisshammer，2002;Yeliseevetal.,2005)。一种识别牛视紫红质 C 端的抗体层析柱（104311-tibody;MoldayandMacKenzie,1983) 可用于一步纯化视紫红质（Oprianetal.,1987;ReevesetaL，1”9) 和 C 端融合了 1D4 表位标签的少肾上腺素能受体 (Chelikanietal.，2006)。
亲和标签的准确位置 (如远离受体的跨膜核心或接近跨膜螺旋) 决定了受体和亲和树脂的结合步骤应该采用批量混合 (inbatch) 或采用柱上 (incolumn) 方式。太接近跨膜核心的亲和标签也许会部分地被受体蛋白周围的去污剂层遮蔽，因此不易接近亲和树脂。
这种情况下长时间混合加载会更有效地捕获受体 (WeiBandGrisshammer,2002)。而亲和标签暴露良好的受体可直接加载到树脂填充的层析柱上，较短的暴露时间就能使纯化标签与亲和树脂结合。批量混合纯化步骤必须手动操作，而层析柱加载可以自动操作 (WhiteetaL，2004)。虽然与蛋白质结合的去污剂的准确含量依赖于各去污剂的性质，但作为一般的指导原则，低临界胶束浓度的去污剂比高临界胶束浓度的去污剂在膜蛋白周围形成更大的去污剂层 [见Bamber等 (2006)]。因此, 与高临界胶束浓度的去污剂相比，低临界胶束浓度去污剂会降低亲和标签与树脂的可接近性。
许多实验室使用 IMAC 作为第一步富集步骤。商品化的树脂类型有 Ni2-NTA 树脂（Ni2+-nitrilotriacetate,Qiagen)、Talon 树脂（Co2+-carboxymethylaspartate，Clontech)和 IDA 树脂 (iminodiacetate，Zn2+,Ni2+，Co2、GEHealthcare)。然而，不同 IMAC 树脂的性质稍有不同 (WeiBandGrisshammer,2002)。例如, 与 Talon 树脂相比，Ni2+-NTA 树脂不仅能更强的结合目标膜蛋白，也会结合更多的污染物。受体的表达水平 (如目标受体和杂质的比例) 决定了第一步纯化的效率。表达量越高, 第一步纯化效率越高。用一步 IMAC 纯化突变的/V 肾上腺素能受体能够达到大于 90% 的纯度（HansonetaL,2008)。
某些情况下，IMAC 树脂结合去污剂增溶受体的能力低于与可溶蛋白质结合的能力 (WeifiandGrisshammer，2002;Whiteetal.，2004)。
纯化的时间和步骤都应该保持到最小值，因为纯化的所有阶段都会引起蛋白质的损失。
