蛋白质分析技术(Analytical Techniques for Protein)-2
二、透析和超滤
1.透析（Dialysis）：
就是利用蛋白质分子不能通过半透膜（Semipermeable membrane）而小分子可以自由透过的性质，使蛋白质与小分子物质分开。
作用：脱盐、无机离子和小分子物质等。
透析膜：动物膜、羊皮纸、火棉胶、赛璐玢或其他材料等。
2.超滤（ultrafiltration）：
是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量的物质分离的技术。
Ultrafiltration的功能：纯化和浓缩（同PEG，聚乙二醇）。
Ultrafiltration膜：丙烯晴、醋酸纤维素、硝酸纤维素和尼龙等。
第三节 蛋白质的电泳技术（electrophoresis）
一、基本原理
1. 分子的运动速度与迁移率
（1）蛋白质分子在电场中的泳动速度（v）
F电场力 = (E/d) q；F阻力 = 6πrηv；
当F电场力 = F阻力时， (E/d)q = 6πrηv，
v = Eq/(6πrηd)。r：分子（半球）半径，
η：溶液 的粘度。
（2）迁移率（M）
M = v / (E/d) = (L/t) / (E/d) = dL / Et
2.影响迁移率的因素
样品：纤维状蛋白质和球状蛋白质具有不同的摩擦力→不同的迁移率。
缓冲液
①离子强度：0.05~0.1摩尔浓度（最适宜的离子强度）。
②pH：决定蛋白质带净电荷的多少。
支持介质 一般用比较惰性材料
①吸附作用 对样品有滞留作用，形成拖尾→带不清晰，分辨力降低。例如：纸的吸附作用强，醋酸纤维素可以消除这种现象。
②电渗作用 电泳缓冲液相对于固体支持介质的相对移动。
+++o++o++++ +++o++o++++
→
------------------- --------------------------
电渗的结果（造成的影响）：加速阳离子的前进，阻滞了阴离子的移动，但在一般实验中可以忽略不计。如需矫正，用中性分子（葡聚糖）的迁移程度来确定电渗的大小。
③分子筛作用 如凝胶电泳作用：有助于分子大小有所不同的生物大分子的分离。凝胶中交联度↑→孔径减小→大分子移动的阻力↑（与Sephadex凝胶过滤正好相反）。
二、电泳的类型
（一）按有无支持物分
1.不用支持物的电泳（自由界面电泳）：Tiselleas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦（密度梯度）技术、等速电泳技术等。
2. 用支持物的电泳：纸上电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、薄层电泳、非凝胶支持物区带电泳（支持介质有：淀粉、纤维素粉、合成树脂粉末等）、凝胶支持物区带电泳（支持介质有：淀粉胶、聚丙烯酰氨凝胶、琼脂糖凝胶等）
（二）从使用型式上分
水平式、垂直式、板形、柱形、双向电泳、连续电泳、电泳—层析相结合的电泳技术等。
三、醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）
1.醋酸薄膜的结构
纤维素的羟基乙酰化→形成纤维素醋酸酯→溶于有机溶剂（如丙酮、氯仿等）涂抹成均匀的微孔薄膜（均一的泡沫结构，渗透性强）。
2.Cellulose acetate membrane electrophoresis优点：
电渗小、分离速度快、样品用样量少、分离清晰、无拖尾和吸附现象，染色的本底较浅可透明，便于保存和定量分析。
3.应用：
血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、同工酶、胎儿甲种球蛋白以及核酸等方面的检测，适合于医学和临床检验。
四、琼脂和琼脂糖凝胶电泳
1.结构及其特征
琼脂（agar）：红色海藻中提取出来的多聚糖复合物，具有相同的多糖骨架和不同的取代基（硫酸酯基、甲氧基、羧基等）。
琼脂糖（agarose）：取代基最少的一种多糖，其电渗作用远小于agar。
agar和agarose特征：容易制成各种形状的凝胶，容易掌握和保存，凝胶的均一性好、牢固、富有弹性、容易固定和干燥，干膜可长期保存。
2.agar or agarose gel electrophosesis优点
网孔大、液体多而近似于自由电泳；电泳速度快、区带整齐、分辩率高、重复性好；无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外线检测及定量分析。
3.应用
（1）分离血清蛋白、脂蛋白、同工酶等。
（2）与免疫化学结合，发展成免疫电泳技术。
（3）分离和鉴定核酸。
五、聚丙烯酰氨凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）
1.定义：是以人工合成的聚丙烯酰氨凝胶作为支持介质的一种电泳技术。
2. 聚丙烯酰氨凝胶的生成
3. 凝胶网孔的大小和适宜的凝胶浓度（%）
4.PAGE的分类及其功能特点
按形状：圆盘状和垂直板电泳
按凝胶是否一致分：连续电泳和不连续电泳，其中不连续电泳有较高的分辨力（具有电荷效应、浓缩效应和分子筛效应）。
5. PAGE的作用机制
样品胶（常省略）
浓缩胶（大孔胶）：蛋白质介于Cl－和Gly之间。Cl－和Gly之间形成低电导区→高电压梯度→加快蛋白质移动，且胶的孔径大，对蛋白质移动没有阻碍→蛋白质在快离子和慢离子之间被浓缩成薄薄的一层。
分离胶（小孔胶）：Gly在pH8.9下解离度聚增→泳动速度超过蛋白质→高电压梯度消失→蛋白质在均一的电压梯度和pH条件下分离；同时由于胶孔径小，具有分子筛效应→使具有相同电荷，只要分子量大小和形状不同的蛋白质得以分离。
6. PAGE优点及应用
优点：样品用量少，分辩率高
应用：科研、农、医及临床诊断。如蛋白质、酶、核酸的分离及病毒、细菌提取液的分析等。
