蛋白质分析技术(Analytical Techniques for Protein)-1
第一节 蛋白质分离纯化与鉴定的基本原理
一、蛋白质的理化性质
（一）蛋白质的两性电离
pI：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为0，此时的溶液的pH称为~。
体内大多数蛋白质：pI≈pH 5.0。在pH 7.4，大多数蛋白质解离成阴离子。少数蛋白质为碱性蛋白质（如鱼精蛋白、组蛋白）和酸性蛋白（如胃蛋白酶和丝蛋白等）。
（二）蛋白质的胶体性质
1.蛋白质：生物大分子，MW：1~100万，大小：1~100nm
2.维持蛋白质胶体稳定因素
蛋白质亲水基团→吸收水分→水化膜 →防止蛋白质沉淀析出
蛋白质表面带有电荷→稳定胶体→防止蛋白质沉淀析出
（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固
1.蛋白质变性（denaturation）
2.蛋白质沉淀
（1）疏水测链暴露→蛋白质聚集→沉淀（变性）
（2）等电点或去水化膜→蛋白质沉淀（非变性）
3.复性（renaturation）与不可逆变性
（1）renaturation：蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原来的构象和功能，称为~。
（2）不可逆变性：蛋白质变性后，空间构象被严重破坏，不能恢复，称为~。
4. 蛋白质的凝固作用（protein coagulation）
蛋白质经强酸、强碱作用变性后，仍能溶解于强酸、强碱中，若将pH调节至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍能溶解于强酸、强碱中，这种现象称为~。
（四）蛋白质的紫外吸收
蛋白质：Tyr和Trp，280nm有最大吸收值，
故A280∝ protein浓度
（五）蛋白质的显色反应
1.茚三酮反应（ninhydrin reaction）
茚三酮 + 蛋白质 → 蓝紫色化合物（在570nm有最大吸收值）。
2.双缩脲反应（biuret reaction）
CuSO4 + protein or peptide → 紫色或红色
二、分离纯化蛋白质的意义
1.要研究某种蛋白质的结构与功能，生产高活性的蛋白质类激素、酶等，必须separation和purification。
2.在基因工程下游工作中，从“分泌型”的细胞质或从“包涵体”中获取具有生物活性的、纯度好的高蛋白质产品，需要separation和purification
三、蛋白质分离纯化的前处理
（一）生物样品的选择和处理
1.样品的选择：有效成分含量高、来源丰富、保持新鲜、实验条件恒定、取材工艺简单、有综合利用价值等。2.样品的处理
保存：-10℃冰箱临时保存，-20℃冰箱短期保存，-70℃冰箱长期保存。
预处理：包括去除脂肪、结缔组织等。
耐高温的成分：烘干长期保存。
有些样品可先冻干粉，再在冰箱中长期保存。
（二）细胞破碎
机械破碎法：研钵研磨、细菌磨、匀浆器、组织捣碎器、组织分散器。
物理学方法：超声波粉碎机、压碎挤压法、冻融法、渗透压法。
化学法：有机溶剂或表面活性剂→破坏细胞膜的磷脂结构，增加其通透性→导致整个细胞破碎→提取结合蛋白质和胞内酶。
酶学法：酶→降解细胞壁，例如：溶菌酶→降解肽多糖的β-1,4-糖苷键→降解革兰氏阳性菌。β-葡聚糖酶和蜗牛酶→破坏酵母菌的细胞壁。
（三）抽提（extraction）
1.定义：是指在一定条件下，用适当的溶剂和方法，使有效成分充分溶解到溶剂的过程。
2.抽提液应具备的条件：
对有效成分溶解度大、破坏性小
对杂质溶解度小或不溶解
来源广泛、价格低廉
操作安全等
3.抽提应控制的因素：
溶剂的 pH值 pH偏离pI，碱性蛋白质选用低pH，酸性蛋白质选用高pI，但pH不能过高或过低，以防蛋白质变性。
溶剂的离子强度和极性：A.盐溶液抽提时，离子强度较低促进蛋白质的溶解、保护蛋白质活性，离子强度过高则引起蛋白质的salting out。B.有机溶剂抽提脂蛋白、非极性基团较多的蛋白质和酶。
温度：0~10℃。
抽提液的体积：抽提液︰抽提物=3~5︰1。
添加保护剂：β-巯基乙醇、Cys、GSH→防止或延缓-SH氧化。EDTA→防止-SH和金属离子产生沉淀。酶的抑制剂：保护蛋白质不被水解。
四、蛋白质的鉴定
SDS-电泳法、等点聚焦电泳法、N-末端Aa残基分析、HPLC、沉淀分析、扩散分析等。
第二节 蛋白质的盐析与透析
一、盐析法与等电点沉淀法
1.盐析（salting out）
（1）定义：在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高这种现象称为盐溶（salting in），但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析（salting out）。
（2）原理
Salting in：蛋白质吸附某种离子→蛋白质彼此排斥，而蛋白质与水相互作用加强→溶解度提高。
Salting out：大量中性盐加入→破坏蛋白质分子表面的水活膜，降低水的活度，蛋白质表面的电荷被中和→蛋白质相互聚集而析出。
（3）盐析中最常用的盐是：
(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4，尤其以(NH4)2SO4为最佳。
原因：(NH4)2SO4溶解度大而温度系数小，分离效果好，能保持蛋白质的天然构象，且价廉可得，这是蛋白质粗提纯的一种最常用方法。
（4）分级盐析的计算方法
A. 添加饱和(NH4)2SO4溶液
V = V0(S2－S1)/(1－S1)
其中V0为原来溶液的体积，单位为ml。
B.加固体(NH4)2SO4
W = B(S2－S1)/(1－AS2)
其中A、B为常数，与温度有关。W单位： g/L。
C.从有关“生物化学实验书籍”附录查询
2.等电点沉淀法
（1）pH 偏离pI时，蛋白质带相同符号的净电荷而互相排斥→蛋白质溶解度大。
（2）pH = pI时，蛋白质的净电荷为0→蛋白质聚集沉淀
（3）等电点沉淀法的缺点：沉淀不完全。
-
精英视角
-
企业风采
-
项目成果
-
综述
