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蛋白分离的缓冲液系统(Laemmli buffer system Laemmli)比较-2

2020.9.07

堆积和pH值在SDS PAGE系统的相对的重要性

我们经常被问到,是否Novex®预制胶有浓缩胶,如果有,pH是多少。答案是肯定的,有浓缩胶(Novex®,Tris-glycine,和Trince胶),但是浓缩胶和分离胶之间的pH值相同。 pH值的变化依赖于胶的成分。请参看每一个产品以确定pH值。

在应用中发现,与SDS系统中离子种类的不一致相比较,pH值的不一致在浓缩蛋白时具有较小的作用。在Laemmli系统,尽管浓缩胶的6.8的pH值对堆积系统有一个额外的促进作用,但是实际上堆积SDS/蛋白复合物并不需要。

甚至在Laemmli系统分离胶的pH值(8.8)时,甘氨酸的泳动速度是足够慢,大约小于70kDa的蛋白在4%的胶中堆积,类似于在pH值6.8的浓缩胶中的堆积。应该注意到Ornstein和Davis的系统最初形成是用来分离native蛋白。他们发现有效的堆积这些蛋白中的一些需要一个低pH值的浓缩胶。然而SDS结合蛋白与native蛋白相比有一个更大的负电荷密度,结果甘氨酸的泳动速度是足够慢,即使浓缩胶配制成与分离胶相同的pH值,也能在甘氨酸区带的前缘堆积SDS结合蛋白。70kDa大小的蛋白会在pH值8.6-8.8的4%的胶和在pH值6.8-7.2的 4%的胶中保持相同的堆积。

较大的蛋白也将被分离成单独的条带。堆积发生在游离样品溶液和浓缩胶之间的界面,增加了教大蛋白条带的锐度,尽管小蛋白和大蛋白在游离溶液中移动相同,但是当大蛋白接触到浓缩胶,它们的速度比小蛋白减慢的多,因而被有效的浓缩。使用典型的上样体积,浓缩效应产生覆盖全部范围的区带,这些区带与使用pH值6.8浓缩胶获得的区带有同样的锐度。

References:
1 Ornstein,L.(1964) Ann.NY Acad.Sci.,121:321
2 Davis,B.J.(1964) Ann.NY Acad.Sci.,121:404
3 Laemmmli,U.K.(1970) Nature 227:680-685

不连续缓冲系统的比较

在电泳开始的时候, SDS-PAGE 利用不连续系统,在浓缩胶中浓缩或"堆积"样品,使其成为一条非常锐利的区带。在不连续缓冲系统中,最初胶中的阴离子不同于(或不连续)电泳缓冲液中开始时的阴离子。 NuPAGE?系统(Bis-Tris和Tris-Acetate)和Laemmli(Tris-Glycine)系统二者均为不连续系统的例证,以相同的方式起作用。但是,作为NuPAGE?系统中不同离子的结果,这个系统在一个较低的pH值下工作。

Tris-Glycine系统(图 1)的情况,主要包括三种离子:
a) 氯(-),由胶缓冲液提供,由于相对于系统中其它的阴离子,阳极对它具有最高的吸引,因而充当先导离子。
b) 甘氨酸(-),电泳缓冲液提供的主要的阴离子,由于在一个带电的环境中,它仅仅部分带有负电荷,并且保持在带有更高电荷的氯离子的后面,充当后随离子。
c) Tris碱(+),出现在胶和电泳缓冲液中的共同的离子,在电泳时,Tris-Glycine系统中凝胶和缓冲液的离子形成了胶分离区域的9.5的工作pH值。

图1 Tris-Glycine System
NuPAGE® Bis-Tris系统(图2)的情况,主要包括三种离子:
a) 氯(-),由胶缓冲液提供,充当快速移动的先导离子。
b) MES或MOPS(-),(取决于电泳缓冲液的选择)充当后随离子。
MES: 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid
MOPS: 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid
c) Bis-Tris碱(+)充当出现在胶中的共同离子,Tris(+)由电泳缓冲液提供。
合并低 pH值的胶缓冲液(pH6.4)和电泳缓冲液(pH7.3-7.7)导致了电泳时显著降低的工作pH值
NuPAGE® Tris-Acetate系统(图3)的情况,主要包括三种离子:
a) Acetate(-),来自于凝胶缓冲液先导离子。
b) Tricine(-),来自于电泳缓冲液的后随离子。
c) Tris(+),共同离子(凝胶和电泳缓冲液)。
这个系统也在一个比Tris-Glycine系统显著低的pH值下运行。
下图总结了每一个系统的浓缩胶的迁移差别。

图3 NuPAGE® Tris-Acetate System
不同缓冲系统的分子量标准的精确校准

通常,SDS胶中蛋白的迁移是处于完全变性状态下蛋白长度的函数(1)。通过与已知分子量大小的蛋白标准的标准曲线比较,根据样品蛋白的相对移动来推断它的分子量。但是,当在不同的 SDS-PAGE缓冲液系统进行电泳时,相同的分子量标准可能有轻微不同的迁移,因而导致明显不同的分子量差别。

二级结构的作用

使用SDS-PAGE进行分子量校准,与一个蛋白的真实的分子量(绝对的校准来自于已知的氨基酸序列)的轻微的偏离可能发生,主要是由于保留的不同程度的蛋白的二级结构,即使是存在SDS。在具有高度组织的二级结构的蛋白(例如胶原蛋白,组蛋白,或高度疏水的膜蛋白)和相对于肽总的大小,局部二级结构的效应变得扩大的多肽,这种现象变得更加普遍(2)。

pH值的影响

当相同的蛋白在不同的SDS-PAGE缓冲系统进行电泳时,也可以观察到蛋白迁移的轻微差别的发生(2)。每一个SDS PAGE 缓冲系统具有不同的pH值,这将影响蛋白的电荷量和结合SDS的能力。尽管天然蛋白迁移的改变通常很小,但是"非典型"或者化学修饰的蛋白,如预染的标准,变化很显著。

蛋白移动的例证

有例证表明,当MulitiMark® Muli- Colored 标准,在Tris-Glycine胶上电泳时,与在NuPAGE® Novex Bis-tris胶上,使用MES SDS或者 MOPS SDS电泳缓冲液比较,发生了蛋白迁移改变的情形。与Tris-Glycine系统比较,MulitiMark®标准在 NuPAGE® Novex Bis-tris缓冲系统中两个肌红蛋白(myoglobin)(红和蓝)位置颠倒。这一现象可以通过应用在NuPAGE系统电泳的MulitiMark®标准再次计算值来解决。

计算和指示的分子量

当前 Novex®分子量标准提供的表观分子量值来源于在Tris-Glycine SDS-PAGE系统。我们已经计算和指示了在几种电泳胶/缓冲系统中 Novex® pre-stained markers 的表观分子量,包括Novex® Tricine 胶系统和NuPAGE® Novex系统。记住要使用与你的凝胶匹配的分子量,以最精确地校准你的目的蛋白。你也可以在你的实验室使用选择的缓冲系统用作Novex?标准作标准曲线。

批与批之间分子量一致性

需要记住的重要一点是,假说凝胶使用相同的缓冲系统,invitrogen生产的所有的标准,从一个批号到另一个批号,从一块胶到另一块胶,经过严格质量控制以达到的迁移一致。

参考文献
1. Rodbard, D.(1976) meth.PROTEIN se2: 145-128.paration
2. Patton,W.F.et al(1991)Anal. Biochemistry, 200:25-30.
3. Wyckoff,M.et al. (1977)Anal. Biochem. 78:459-482.


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