小分子抗原制备要点和注意事项-2
在Eva
M.Brun等（2004）的实验中，根据待测物杀螟松的结构设计了多种半抗原的组合，具有特异性的结构的是用椭圆标记出来的，在连接偶联臂时就要充分考虑暴露这一重要的抗原表位，研究中通过对比接入偶联臂的不同结构的半抗原，显示充分暴露该结构的F7半抗原制备人工抗原免疫动物得到的多克隆抗体，具有最好的灵敏度和效价。（Eva
M.Brun et al，2004）
8、间隔臂的介入位点，最好远离特征性的基团，而且要尽可能保存特异性较大的杂原子或带侧链的碳链结构，联入的间隔臂最好在苯环或其他杂环的碳原子上，这样可以最大程度的保证半抗原的极性与目标待测物的一致性，如果有远离大环的碳链结构，那么碳链的末端也是一个很好的介入位点，因为这样的结构对大环的电子排布影响较小。（Young
Ae Cho et al ，2004）
9、除了间隔臂的接入位点以外，间隔臂本身的结构也是影响半抗原合成是否成功的重要因素。虽然半抗原接入间隔臂是必要的，但间隔臂太长会导致半抗原分子的折叠，使其更接近载体蛋白，屏蔽作用增强。一些学者认为理想的间隔臂长度是中度的3－6个直链碳原子构成，这时得到抗体的灵敏度要高于间隔臂很短的人工抗原制备的抗体（6，13，20，21），但在另外的试验中，使用零间隔臂的免疫原也得到了特异性很好的抗体。
在Yoo Jung
Kim实验中，在间隔臂介入位点为最佳的时候，当间隔臂的长度在2-6之间时，分别制备了人工抗原，在载体蛋白以及其他的免疫程序一致的条件下，不同免疫原产生的抗体在亲和能力和灵敏度方面都没有明显的差异。也说明在间隔臂长度适中的情况下，间隔臂的长度对免疫检测的灵敏度没有明显的影响。
10、间隔臂的选择，一般间隔臂要求本身不要产生针对间隔臂的抗体，而且对半抗原的结构影响要小，并且末端要含有能与载体蛋白氨基或羧基偶联的活性基团，一般为氨基，羧基，或羟基。间隔臂与小分子半抗原连接一端，最好以单纯的碳链连接，如果难以实现也要选择电性较低的连接基团，试验证明以酰胺键相连接，产生的抗体对间隔臂有很高的亲和系数.
11、有试验表明当联入的间隔臂末端为羟基时，产生抗体的灵敏度要明显高于相同条件下间隔臂以羧酸基团为末端的人工抗原制备的抗体。这可能因为含间隔臂半抗原末端不同，所以与载体蛋白的偶联方式不同，所以含羟基的半抗原可以提高半抗原与载体的偶联比，并且能够更好的暴露半抗原的抗原决定簇。（Brun
et al，2004）
12、虽然对于含多个特异性结构的大分子化合物来说，用含苯环的间隔臂或零间隔臂同样可能制备处特异性好，灵敏度高的抗体。但现在很多试验都证明，选择简单的中长度的碳链对于半抗原合成是最佳选择，也是小分子药物半抗原合成选择间隔臂的通用方法。
13、用作载体的有蛋白质类、多肽聚合物、大分子聚合物和某些颗粒，常用的有明胶、牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白、卵清白蛋白（OVA）、匙孔血蓝蛋白（KLH）等。选择载体要综合考虑分子量、活性基团、溶解度及来源，价格等因素。明胶做为载体免疫原性差，需要多次免疫。匙孔血蓝蛋白（KLH）价格昂贵，虽然免疫原性强，但它激发的B淋巴细胞克隆中针对自身抗原决定簇的多，相对减少了针对半抗原的B淋巴细胞克隆，增加阳性克隆筛选的难度和工作量（Fasciglione
et
al.，1996）。一般认为，用与免疫动物亲缘关系较远的蛋白作为载体可能会更好，BSA与HSA都是良好的载体蛋白，均能刺激动物产生特异性抗体，并且BSA、HSA和OVA这几种载体分子量适中、来源容易、价格便宜、水溶性好，故常用作半抗原载体；此外BSA、HSA和OVA都具有大量的反应基团，如氨基、羧基等，且能在水相或某些有机溶剂的混合物中充分溶解，使偶联反应可在较高浓度的反应物存在条件下进行，据报道，每分子BSA有60个游离氨基，每分子OVA有20个游离氨基（NCBI蛋白质数据库）可以和合成半抗原的羧基反应形成肽键，合成免疫原。
14、由试验表明在单克隆抗体的制备过程中，脂蛋白－Th细胞抗原决定基载体蛋白（Pam3Cys-TH）制备抗体的灵敏度高于用BSA，KLH作为载体蛋白制备的抗体，可能因为这种载体蛋白的支链更长。用BSA或KLH作为载体制备抗体的亲和力很差，因为分子在体内很快被肾脏系统消除，而新载体
Pam3Cys-TH就克服了这样的问题。（Hoffmann et al.，1997； Baier et
al.，2000）。并且Pam3Cys-TH本身就可以做为佐剂使用，所以产生的免疫反应非常强，有利于产生高亲和力的抗体。
因为抗原展示细胞（APC）表面是带负电荷的，通常认为如果载体蛋白经过离子化处理带有正电荷，就更容易结合到带负电荷的细胞表面，能引起更强的免疫反应。（Apple et al.，1988）
以上仅是作者查文献的一些总结，而且很多结果都不能从原理上解释清楚，所以抗体制备的时候最好还是多考虑几种抗原设计方案。根据初步筛选的结果确定用哪种抗原免疫的动物做融合。
