法医 ＤＮＡ检测平台的研究进展与比较研究
法医 ＤＮＡ检测平台的研究进展与比较研究
摘要：现代科学技术带动了 ＤＮＡ检测技术在法医领域的不断发展．以目前世界上比较先进的三个 ＤＮＡ检测平台为例，探讨法医 ＤＮＡ检测平台的研究与应用．每项技术有其优缺点，在实际的法医 ＤＮＡ检 测中，要灵活地选用检测平台，以促进工作的顺利开展．
近几年来，中国社会刑事犯罪率不断上升，造成极紧张 的社会氛围．加强刑事案件侦破手段，成为现在依法治国的 重要内容．ＤＮＡ检测技术作为一项能够准确识别生物特征的 技术，为法医学鉴定提供了科学的依据，因此也成为现代最 重要的刑事技术手段． 我国刑事侦破对 ＤＮＡ检验技术的应用是逐年递增，截 至 ２０１５年，公安机关在办案实践中，利用 ＤＮＡ检测技术识 别 ７０余万涉案人员，认定 ８１万余起各类刑事案件，另外鉴 定被拐卖、失踪儿童 ４９００人．ＤＮＡ检测技术的引用，严厉打 击了刑事犯罪，极大维护社会稳定．因此一直得到世界法医 界的重视．尤其是对法医 ＤＮＡ检测平台研究与应用，各国都 设立专门的研究组织与部门，纵向挖深 ＤＮＡ检测技术．以美 国为主的发达国家，不断推出新的 ＤＮＡ检测技术，比如新款 ＡＢＩ３５００遗传分析仪、采用微流控技术快速 ＤＮＡ检测仪以及 ＮＧＳ新一代（二代、三代）测序平台等．二代测试平台已经在 发挥重大的法医 ＤＮＡ检验作用．公安部在“十一五”中首次 使用我国成功研发的首台法医 ＤＮＡ检测平台，打破了国外 技术垄断．随后的“十二五”“十三五”期间，警察机关紧跟国 际水平，引领我国法医 ＤＮＡ检测平台研究与应用． １ ＧＡ１１８系列法医 ＤＮＡ遗传分析仪的研究发展 （１）在 ２０１２年左右，美国 ＦＢＩＣＯＤＩＳ把 ＳＴＲ位点从 １３ 个增加到 ２０个，利用六色荧光光谱处理技术，提升了识别个 体与亲缘复杂关系的能力［１］ ．基于新增的 ＳＴＲ位点检测，公 安部法医研究所也开始对 ＧＡ１１８系列法医 ＤＮＡ遗传分析仪 的光谱分析技术进行升级研究，校正空间、光谱，优化 ＳＴＲ数 据的预处理与质量评价流程．从五色增加到六色的技术算法 系统，相应增加同个电泳通道能够检测的颜色．因此六色荧 光屏技术对于 ＤＮＡ检测技术的综合发展具有重要意义，体 现软硬件与试剂耗材性能的良好结合．六色荧光光谱处理技 术工作有四个环节：１）依据需要检测样本，选择、设计具有六色试剂体系 ＳＴＲ工作模型，规划 ＤＮＡ检测平台阶段程序的 动作程序；２）参照六色试剂燃料情况，查找光谱分布矩阵，分 析逆运算，并使用事前算法校矩阵；３）发送命令集，仪器硬件 平台接收后，对六色 ＳＴＲ数据进行采集，并依据实时基线进 行校正处理；４）对 ＳＴＲ数据进行综合检测，全面分析处理文 件信息、光校正信息、样本信息、运行信息等，将含有六色试 剂 ＤＮＡ数据信息以 ＦＩＤ、ＡＢＩＦ的数据格式输送出来． 依照上面步骤进行 ＤＮＡ测试，最终得出，六色 ＤＮＡ荧 光光谱中的数据信息，是可以被 ＧＡ１１８系列法医 ＤＮＡ遗传 分析仪准确采集．并通过光谱矩阵建模，精确分析 ＳＴＲ荧光 光谱．利用分析仪呈现出六色荧光光谱的情况，实现识别个 体生物特征与复杂的亲缘关系． （２）ＤＮＡ遗传信息库的规模不断扩充庞大，ＤＮＡ数据对 于刑事侦查的作用也在不断加大．一系列中高通道系列的 ＤＮＡ遗传分析技术应运而生，ＰＣＲ体系就是其中一例．ＰＣＲ 体系的初衷就是为减少在庞大的 ＤＮＡ数据库中的检测时 间．为处理这项难题，公安部法医研究所以 １６通道毛细管电 泳 ＤＮＡ遗传分析仪为技术基础，创新研究 ２４、９６中高通道 法医 ＤＮＡ遗传分析仪．如果说 ＧＡ１１８系列的 １６Ａ法医 ＤＮＡ 遗传分析仪是技术与材料的综合，２４、９６中高通道法医 ＤＮＡ 遗传分析仪则是系统的综合，引进激光诱导技术，构建荧光 检测系统，并且对进样、恒温、数据输送与处理等系统，都进 行一定的更新，整体性提高了遗传分析仪技术．以 ＧＡ１１８－ １６Ａ为原型，２４、９６中高通道遗传分析仪器，使用小体积、低 耗能、寿命更长的固体激光器，淘汰了氩离子气体激光器，提 高激光传输系统的工作效率．荧光光谱检测系统上，长波通 滤光片具有大视野场角，准直孔径更大，可以镜头成像，配备 ５１２５１２制冷 ＣＣＤ，保证技术的均匀性，可以检测宽光谱范 围荧光光谱；恒温系统上，引进格栅与 ３Ｄ均匀循环恒温技 术，优良创新风道设计，提高热传导与温控系统的工作效率，实现了体积增大、灵敏度提高的系统目标；在 ＳＴＲ数据软件 系统上，利用先进 ＣＣＤ驱动时序电路设计，采用嵌入式电路 设计，完善 ＣＣＤ数据采集电路，强化采集与传输空间、数据 的方法，对空间、光谱、ＳＴＲ数据采集算法进行更加严格地校 正．因此，从整个系统上进行分析，２４、９６中高通道遗传分析 仪具有全面的改进，尽管现在这两种 ＤＮＡ检测平台在法医 实践中并未正式使用，但是 ２４通道 ＤＮＡ遗传分析仪已经完 成原样试机，９６ＤＮＡ遗传分析仪则正在进行系统调试． （３）ＤＮＡ遗传分析仪只是在技术层面完成了 ＤＮＡ数据 检测工作，对于数据的分析，另外还有评判专家系统．与 ＧＡ１１８系列法医 ＤＮＡ遗传分析仪同步发展起来，ＤＮＡ遗传 数据评判专家分析系统与其同轨而行，紧密相连，也是刑事 侦查员分析 ＤＮＡ遗传信息数据的平台．ＤＮＡ遗传信息数据 评判专家系统，直接得出 ＤＮＡ遗传信息的结论，常用在法医 与鉴定亲缘关系、染色体与 ＤＮＡ异常诊断、ＳＮＰ分裂等方 面．但是，我国 ＤＮＡ遗传数据评判专家分析系统起步相对较 晚，在国家“十一五”期间，公安部物证鉴定中心开始研究 ＤＮＡ分析技术，取得良好成就． 公安部法医研究所加深研究六色试剂 ＤＮＡ数据分析技 术，核心部分有：Ｌａｄｄｅｒ分型参照系建立方法、ＤＮＡ分型质量 评价方法、ＳＩＺＥ内标的定标方法与 ＤＮＡ分型质量评价方法， 分别取得重大的研究成果．以相关试剂体系为基础，完善六 色 Ｌａｄｄｅｒ分型参照系，在技术上实现定长 ＤＮＡ片段，提升基 因分型数据处理技术． 在六色试剂 ＳＩＺＥ定标上，ＧＡ１１８系列遗传分析仪建立 了完整的六色光谱数据的 Ｓｉｚｅ基线调整、谱峰识别、标准谱 峰序列匹配、ＳＩＺＥ定标、ＳＩＺＥ质量评价流程；在 Ｌａｄｄｅｒ分型 参照系上，ＧＡ１１８系列遗传分析仪基于 Ｐａｎｅｌ、Ｍａｒｋｅｒ、Ｂｉｎ参 考数据，重构了六色试剂体系 Ｐａｎｅｌ、Ｍａｒｋｅｒ、Ｂｉｎ，实现了实际 六色试剂体系的 Ｌａｄｄｅｒ谱峰位置和参考 Ｌａｄｄｅｒ位置的正确 匹配；在 ＤＮＡ样本分型上，ＧＡ１１８遗传分析仪采用前面步骤 生成的六色 Ｌａｄｄｅｒ分型参照系，成功实现了 ９９４７标准品和 实际 ＤＮＡ案件样本的 ＳＴＲ分型，在技术上实现六色荧光光 谱试剂体系的 ＤＮＡ片段定长和基因分型数据处理． ２ 微流控快速 ＤＮＡ分析仪的研发 法学证据的搜集比较重视及时性与现场性，这促使发达 国家研发新的 ＤＮＡ检测平台，以微流控技术为基础研发的 ＤＮＡ检 测 仪 即 是 最 好 平 台．美 国 ＩｎｔｅｇｅｎＸ公 司 研 发 的 ＲａｐｉｄＨＩＴ２００就是利用微流控研发出的具有代表性的 ＤＮＡ 检测仪器． ＲａｐｉｄＨＩＴ２００结合 ＭＯＶｅ流体集成技术与流控芯片，更 迅速地处理血拭子样品与咽拭子．利用一次性的芯片匣，该 系统可单次以对 ４－８个拭子样品进行处理，在 ９０分钟内生 成 ＣＯＤＩＳ兼容的结果．整机相对紧凑，重量约为 ８１．５ｋｇ，尺寸为 ４８ｃｍ×７３ｃｍ×７１ｃｍ．样品细胞在芯片上进行裂解后，使 用磁珠对其中的 ＤＮＡ进行提取和纯化，完成 ＳＴＲ位点扩增， 最终产物在芯片外的毛细管进行电泳分离． 进行 验 证 测 试 时，美 国 ＧＥ和 Ｎｅｔｂｉｏ公 司 合 作 的 ＤＮＡＳｃａｎ系统测试结果，相比 ＲａｐｉｄＨＩＴ更加接近．ＢｉｏＣｈｉｐＳｅｔ 匣不仅整合了样品提取和扩增用的微流控芯片，也集成了毛 细管电泳芯片． 对于快速 ＤＮＡ检测系统的设计，公安部也利用微流控 技术加大对其研究，设计版块主要有四个：样品处理、分离、 检测、分析．利用微流控技术处理样品，与原来 ＤＮＡ检测系 统大不相同，也是整个 ＤＮＡ检测系统的核心部分．输入系统 样本为拭子，快速裂解细胞、提取 ＤＮＡ、扩增位点、检测分离， 最后输出 ＳＴＲ位点的数据信息．选择样本数目在 ５至 １６个 之间．既可以满足实际需要，又能节约仪器成本． 处理模块具备核心的微流控芯片，在设备配套上也比较 齐全，包括气压、温度控制系统与样品储存系统．使用塑料芯 片就可以，既方便加工，又可降低成本，常用的是聚丙烯、共 聚物、环烯烃聚合物．芯片当中有液体与气体管路，具有多层 化，以气路的正负电压控制阀门开闭，实现流体控制技术．进 行毛细血管电泳时，以高压电源与温控原件实现快速的温度 控制，制造紧凑的仪器体积环境，缩短分离时间． 拭子上的细胞经过充分的裂解后，使用磁珠或者硅胶柱 进行分离纯化，洗脱后进行若干个 ＳＴＲ位点的多重 ＰＣＲ扩 增．芯片上的 ＰＣＲ扩增的体积通常不超过 １０μＬ，方便实现快 速的变温．同时选用快速的 ＰＣＲ酶，最终将传统的超过 ２个 小时的 ＰＣＲ反应缩短到 ３０分钟内．扩增产物在分离系统中 进行毛细管电泳． ３ ＮＧＳ新一代 ＤＮＡ测序仪 在法医学应用上，ＮＧＳ新一代测序技术可谓大展手脚， 在近几年迅速发展起来，同时被法医界称为“深度测序技 术”，“第二代测序技术”． ＮＧＳ新一代测序技术近几年的应用领域非常广，其摆脱 传统电泳的技术，具有高通量的技术特点．相比上一代，ＮＧＳ 新一代测序技术边合成边测试的工作方法，可以对 ＤＡＮ数 据实时监测，避免操作时间过长出现过度变化的情形．其中， 具有代表性的包括基于焦磷酸测序的 ４５４测序技术（检测化 学发光），ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ测序技术（检测微小的 ｐＨ变化），基于 连接酶测序的 ＳＯＬｉＤ技术和 ＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅｎｏｍｉｃｓ技术，基于单 分子聚合酶延伸过程检测的 Ｈｅｌｉｃｏｓ技术 和 ＰａｃＢｉｏ技术以 及目前占据最主要地位的基于荧光标记和可逆保护集团的 聚合酶延伸的 Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ技术［２］ ．这些技术大大提高测 序通量和速度，同时显著降低了测序成本．这些技术不仅在 医疗和生命科学研究得到了应用，也在法医鉴定，农业、畜牧 业育种，现代生物育种等方面发挥了重要作用．ＮＧＳ新一代测序技术一直是法医学领域关注的焦点．至 ２０１５年 ９月，相关的学术研究数量十分多，ＰｕｂＭｅｄ检索的国 际学术论文数量已经达到 ２００多篇．美国产业界一直非常重 视对 ＮＧＳ新一代测序技术的研究，不断对 ＤＮＡ检测平台进 行创新，增长法医试剂盒，增加 ＤＮＡ检测的初始量，达到 １００ｐｇ～１ｎｇ，能够检测 ２３１个 ＳＴＲ位点［３］ ． 这项技术很好地适应侦查机关对刑事证据侦查的要求， 在辨别与分析当事人 ＤＮＡ数据上及时便捷．因此法医学领 域的关注度非常高．许多 ＤＮＡ技术发明公司，也在不断地加 大对其研究与开发，发明出不同系统的检测系统，不过也遇 到了一些相应问题．然而，不论怎么说，ＮＧＳ新一代测序技术 代表着一个发展趋势． ＮＧＳ新一代测序技术的不同系统各有优劣，共同推动了 基于 ＮＧＳ新一代测序技术在法医学上的应用．这类 ＮＧＳ新 一代测序平台具备强大的 ＤＮＡ测序数据生产能力，采用多 重测序的办法提高 ＤＮＡ测序质量，在法医学应用上可给出 更加丰富的 ＤＮＡ序列信息，在降解 ＤＮＡ分型、复杂混合样 本解析、复杂亲缘关系鉴定、表型推断等法医 ＤＮＡ应用领域 具备优势．同时，ＮＧＳ新一代测序技术在法医 ＤＮＡ领域广泛 应用还要面临一些挑战：１）基于 ＮＧＳ新一代测序技术的法 医 ＤＮＡ检测平台仪器、试剂耗材还非常昂贵，需要进一步降 低成本；２）基于 ＮＧＳ新一代测序技术的法医 ＤＮＡ检测平台 产生的数据量非常大，相关数据信息处理需要较强大的计算能力，存储和管理需要更多的硬件支持［４］ ． ４ 结语 法医 ＤＮＡ检测平台在科技发展形势中，肯定还会有新 的突破．尽管目前 ｓａｎｇｅｒ测序技术是目前法医检测平台的黄 金标准，代表现在国际最高水平，但是在未来法医领域，ＳＴＲ 位点数量会不断增多，ｓａｎｇｅｒ测序技术同样也会面临挑战．因 此，要促进法医 ＤＮＡ检测平台不断走向完善，更好地服务于 刑事证据的鉴定识别，打击刑事犯罪，发挥现代技术的社会 治理功能．ＤＮＡ检测技术的进一步完善，也是需要相关技术 人员与广大社会公民的不懈努力．
