法医 SNP 复合检测体系的构建及应用
【摘要】目的 构建48-SNP 位点复合检测体系，用于个体识别、性别鉴定、ABO 基因分型。方法 采集225 份无关个 体样本( 血斑及口腔拭子) ， 18 份案例样本( 不同组织及体液斑) ，选择43 个常染色体位点、 4 个 ABO 基因位点和1 个性别 鉴定位点，根据单碱基延伸技术通过 GenomeLabTM SNPstream基因分型系统进行 SNP 分型;并检测体系灵敏度、同一个体 不同组织同一性及模拟腐败检材。结果 48-SNP 体系分型结果与测序结果的一致性为100%，最小 DNA 检出量为 0. 25ng，不同组织来源样本检测同一性很好;利用该体系检测225 名无关汉族个体，所有位点均符合 Hardy-Weinberg 平衡， 整个系统的随机匹配概率为9.4 ×10 －18，累积非父排除率( CEP) 为0.999 788，累积个体识别率大于0.999 999 999 999 999 99。 结论 本文48-SNP体系能同时进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定，可以作为现有STR检验体系的补充。 【关键词】法医物证学; SNP 复合检测体系;单碱基延伸; SNP;个体识别
STR 复合扩增法已为目前法医 DNA 检验常规使 用。但由于对物证证据要求不断提高，需要 DNA 检 验提供更多的信息。SNP 突变率低，数量多、在基因 组中分布广泛;因其扩增片段长度短而利于对降解检 材的检测，且因具有自动化、高通量、快速检测的特点 而越来越受到重视［1-4］。本文针对 GenomeLabTM SNPstream基因分型系统采用单碱基延伸技术［5］进行 SNP 分型，建立法医 SNP 复合检测体系，并对该体 系指标进行验证评价。 1 材料与方法 1. 1 样本 225 份汉族无关个体样本，其中口腔拭子103 份、 FTA 卡静脉血样 122 份，采集于北京市中关村医院; 18 份案例检材( 包括骨骼、牙齿、指甲、高度腐败的肌 肉、脱落细胞、唾液斑等) ，为本实验室日常检案积累; 2 名男性尸体心、肝、脾、肺、肾、大脑、皮肤、肌肉、软 骨组织样本，由北京市公安局法医中心提供。 1. 2 DNA 提取 103 份口腔拭子、122 份 FTA 卡静脉血样和18 份 案例检材 DNA，采用 PuriTyperTM法医学 DNA 纯化试 剂盒( 公安部物证鉴定中心) 提取;2 份男性个体的组 织样本使用 MagAttract DNA Mini M48 DNA 提取试 剂盒( Qiagen 公司) 提取。 1. 3 引物 48 个 SNP 位点( 含 43 个个体识别位点、 4 个 ABO 基因型位点及 1 个性别位点) 的 PCR 扩增引物 和单 碱 基 延 伸 引 物 用 Autoprimer 软 件 ( www． autoprimer． com) 设计。所有引物由上海生工生物工 程技术服务有限公司合成，每对引物均经过 2%琼脂 糖凝胶电泳检测。 1. 4 PCR 扩增与纯化 分4 组进行扩增，每组 12 个 SNP 位点( 24 条引 物) ，每条引物终浓度为10μmol/L。 扩增总体系为5μL 体系，内含:2 ～20ng/μL 模板 DNA， 10μmol/L PCR 引物池，75μmol/L dNTP，10 × PCR Buffer( 含 15mmol/L Mg2 + ) ，25mmol/L MgCl2， 5U/μL HotStar Taq。扩增循环参数:95℃ 15min 预变 性，94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min，40 个循环，最后 4℃恒温保持。 纯化体系为 8μL，内含: ExoⅠ酶，SAP 酶，10 × SAP 缓冲液及 PCR 扩增产物。纯化条件: 37℃ 30min，96℃ 10min，4℃恒温备检。 1. 5 引物延伸 延伸引物分4 组，每组12 条，每条延伸引物终浓 度为10μmol/L。 引物延伸总体系为15μL，内含:延伸缓冲液， 20 ×延 伸Mix(荧光 ddNTP)， 10μmol/L 延伸引物池，DNA 聚合 酶以及PCR 纯化产物。纯化循环参数:96℃ 3min，94℃ 20s、40℃ 11s，循环46 次，最后4℃恒温备检。 1. 6 杂交 杂交体系为23μL，内含杂交缓冲液( Beckman 公司) 及引物延伸产物; 将混合好的杂交溶液加入到 SNPware 杂交板( Beckman 公司) 上对应孔内，将杂交 板放入密封盒中 42℃ 2h; 缓冲液( Beckman 公司) 清 洗杂交板2 次，300rcf 离心1min，重复3 次;取无尘纸 浸润无水甲醇擦净杂交板背面后置 SNPstream 图像 分析系统，双色荧光 CCD 扫描，SNPadmin、Image 和 GetGenos 软件分析检测结果。 2 结 果
2. 1 系统检出率 225 份样品理论上应检出10 800 个基因型( 48 位 点 ×225 份样品) ，通过本文构建的48-plex 体系共检测 出10 733 个基因型，总体检出率为99. 38%，口腔拭子 和 FTA 卡静脉血样均能获得很好的分型结果。 2. 2 系统准确性 分型验证 随机抽取8 份 DNA 样品，用本文方法 对48 个位点( 384 个基因型) 进行分型检测。PCR 扩增 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，由北京迈奥德恩生物科 技有限公司进行测序。所有分型结果与测序均一致。 性别检验 在 225 份个体样本中，男性 117 份， 女性108 份，采用本文方法检验，结果性别检验( Amel 基因上1 个 SNP 位点) 结果均正确( 男性为 GA，女性 为 GG) ，ABO 基因型检验 用本文方法对 225 份样品的 ABO 基因型进行检测，结果均与血清型分型一致
2. 3 群体遗传学调查 利用本文方法对 225 名北方汉族无关个体样本 48-plex 体系遗传多态性进行检测。结果所有位点均符 合 Hardy-Weinberg 平衡， 43 个个体识别 SNP 位点间不 存在显著连锁不平衡( r2 ＜ 0. 05) ，杂合度 0. 390 7 ～ 0. 501 1，DP 值 0. 486 5 ～ 0. 662 5。系统随机匹配概 率为9. 4 ×10 －18，累积非父排除率为 0. 999 788，累积 个体识别率大于0. 999 999 999 999 999 99。 基于本研究样品的基因分型结果和 HapMap 数 据库中11 个群体已有数据信息［9］，计算每个位点的 Fst 值，验证 SNP 系统在不同群体间个体识别效力的 稳定性。43 个个体识别位点在 12 个群体之间 Fst 值 的分布范围为 0. 002 ～0. 080，其中 3 个位点的 Fst 值 大于0. 06，其余均低于0. 06
2. 4 系统灵敏度 将 1ng/μL DNA 模 板 ( NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer) 稀释为 0. 5、 0. 25、 0. 125、 0. 062 5、 0. 031 3、 0. 015 6、 0. 007 8ng/μL，按本文方法进行 48-plex 复合扩增体系的检测( 重复 5 次) 。结果显 示， 0. 031 3ng/μL 检出率为 95. 00%， 0. 015 6ng/μL 为87. 08%;0. 007 8ng/μL 为78. 75%，余均为100%。 该体系的最低 DNA 检出量为 0. 25ng/μL( 0. 062 5ng ×4) 。 2. 5 组织同一性 用48-plex SNP 体系分别对2 名男性尸体组织样 本进行检测，结果同一个体心、肝、脾、肺、肾、大脑、皮 肤、肌肉、软骨组织分型一致。 2. 6 模拟降解 DNA 检验 取2 mL 新鲜静脉血提取的基因组 DNA 1 份，用 4U DNase I 常温处理 0、 2、 5、10、20、30min 后置于 68℃10min 使Dnase I 失活。应用48-plex SNP 体系和 Identifiler Plus 试剂盒对处理样本分别进行检验。 结果显示，处理 20min 的 DNA 样品，采用 IdentifilerPlus 试剂盒检验， 15 个基因座中 5 个漏检，另有 5 个 基因座峰值较低，在 50 ～ 200 RFU 之间( 图 3) ; 而应 用本文 48-plex SNP 体系全部 48 个 SNP 位点均得到 明确分型。
2. 7 案例检材检验 18 份案例检材，采用本文48-plex SNP 体系检验， 结果显示，90%以上的位点均能明确分型。其中 5 份 检出全部48 个位点( 烟头、腐败肌肉各2 份，口香糖1 份) ， 4 份检出47 个位点( 软骨、螺帽擦拭、果核、腐败 肌肉各 1 份) ， 3 份检出 46 个位点( 骨头、瓶口擦拭、 毛囊各1 份) ， 1 份检出 45 个位点( 牙齿) ， 4 份检出 44 个位点( 骨头、指甲及擦拭物、刀把擦拭物各 1 份) ， 1 份检出43 个位点( 门把手擦拭物) 。其中 1 份 检材是从案件现场发现的果核，采用 DNATyper15 试 剂盒分型获得8 个 STR 基因座的图谱，但峰高均低于 200RFU，采用本文48-plex 系统检测获得了47 个 SNP 位点的分型结果。 3 讨 论 用于个体识别的 SNP 位点选择参照耶鲁大学 Kidd 实验室提出的3 个原则［6-7］:①杂合度高( ≥0. 4); ②不同人群间等位基因频率差别小( Fst 值 ＜ 0. 06) ; ③遗传标记间没有显著性的连锁状态。本文在其筛 选出的92 个用于个体识别的 SNP 位点( IISNPs) 中选 择了 43 个; 同时针对 ABO 基因型，选择 rs8176719 (261delG) 、rs8176720( 297A ＞ G) 、rs1053878( 467C ＞ T)
rs8176747( 803G ＞ C) 4 个 SNPs 位点［8］，可检出 A1、 A2、 B、O1 和 O2 等位基因， 15 种基因型。性别鉴定位 点选自 amelogenin 基因。 本文48 个 SNPs 复合检测体系采用微测序-通用 芯片技术构建，设计的 SNPs 扩增片段长度在 89 ～ 158bp 之间，更适合于高度降解生物检材检测［1］。用 该体系检测 225 份汉族无关个体 DNA 样品，分型与 测序结果的一致性为 100%，表明其特异性和准确度 很高;最小 DNA 检出量为0. 25ng;同一个体不同组织 检测结果一致，表明具有很好的组织同一性; 模拟降 解和实际案例检材检验结果优于 Identifiler Plus 或 DNATyper15 试剂盒。说明本文 48-plex 系统可以作 为现行复合 STR 检测技术的有效补充。 本文48-plex 系统选择了 43 个统计学上独立的 个体识别 SNPs 位点( r2 ＜ 0. 05) ，系统随机匹配概率 为9. 4 × 10 －18，累积非父排除率为0. 999 788。用于 个体识别最好选择低 Fst 值的 SNP［6］，使等位基因频 率在不同群体间的差异最小化，从而避免随机匹配概 率在不同人群间的大范围波动。本文基于本研究样 品的基因分型结果和 Hapmap 中的 11 个群体数据计 算得到的 Fst 值均低于0. 08( 其中40 个位点的 Fst 值 低于0. 06) ，表明48-plex 系统应适用于不同群体的个 体识别，但需相关大数量群体样本的实验证实。 本文48-plex 系统位点数目较多，因受制于 PCR 复合扩增位点数目的限制，需要多管检测，故可致 DNA 模板用量增大，灵敏度有所降低。此外，由于所 选位点均为二等位基因，分型结果很难分辨为单一还 是多来源，故难以用于混合样品分型。除了个体识别 外，SNP 在种族地域、外形体貌等个体表型信息推断 方面具有独特作用［10-11］，本文体系将个体识别与表型 特征( ABO 血型和性别) 合为一体化检测，可随大量 功能 SNP 位点和高通量 SNP 检测技术的发展而得到 广泛应用。
