原位杂交(In Situ Hybridization,ISH)与荧光原位杂交（二）
5．洗膜 取出塑料袋，用剪刀剪开，小心取出滤膜，立即浸入盛有2×SSC和
0.5%SDS溶液的盘中，室温下漂洗5min。再将滤膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中，室温下洗涤15min（轻轻摇动）。然后将滤膜移入
0.1×SSC和0.5%SDS溶液中；68℃轻轻摇动保温2h，更换缓冲液后继续保温30min。
洗膜的温度一般应控制在低于Tm值12℃以上。（Tm = 69.3 0.41x(G C) %）。双链DNA的Tm值随错配碱基对数每增加1%而递减1℃。
6．结果显示 非放射性检测方法前已述及，此处主要介绍放射性测定方法。固相膜的放射性杂交结果显示有两种方式，一是放射性自显影法，另一种是液闪计数法。前一种方法比较简单，只需将杂交膜与X光片在暗盒中曝光数小时至数天，再显影、定影即可。对于杂交信号较弱的固相膜，用一块增感屏可显著增强曝光强度。此外，为了减弱32P的散射，曝光通常在-20℃或-80℃下进行。液闪计数法主要用于打点和狭缝杂交及为了比较两个杂交信号的强弱等情形。方法是将完成杂交的膜在漂洗结束后剪成小块（每份样品1块），80℃真空干燥后装闪烁瓶。加入
2～5ml闪烁液，剪2～3块无样品膜块作为本底对照。在液体闪烁计数器上自动计数。液体计数测定放射性强度也可在放射自显影之后进行。
（二）固相核酸分子杂交类型
1．菌落原位杂交（Colony in situ
hybridization） 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
实验步骤如下：
①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。
②培养细菌至产生1～2mm大小的菌落。
③在一块平皿中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体。将带有菌落的滤膜取下，轻轻置于滤纸上，菌落面上在，注意防止在滤膜底面存有气泡。
④5min后，将滤膜转至用变性溶液（0.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·NaCl）浸湿的滤纸上，放置10min。
⑤将滤膜转至中和溶液（1.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·HCl ，pH8.0）浸湿的滤纸上，放置10min。重复中和1次。
⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min。SSPE配成20×贮备液：3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)。
⑦将滤膜用滤纸吸干，80℃真空烘干2h。
以下操作参考前述。
2．斑点杂交（Dot blot）
斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如Minifold
I和II、Bio-Dot (Bio –Rad )和Hybri
–Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。
