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如何从干燥材料中提取DNA

2021.11.19

  (1)粗提

  ①试剂

  a.1倍 CTAB 提取缓冲液:2倍 CTAB 贮存液稀释1倍,使用前每100mL 加入巯基乙醇0.14mL。

  b.其他试剂与从新鲜材料中提取相同。

  ②操作

  a.称取 1g 干燥材料置研钵中,加入3~4g 铝粉研磨。

  b.将粉末转入离心管中,加入0.6~15mL 1倍 CTAB 提取缓冲液,轻缓地搅拌,使材料充分分散。置56℃水浴中保温10~20min。

  c.冷却至室温,加入等体积氯仿/异戊醇,颠倒离心管混匀。20℃、8000离心力离心10min。

  d.将上相转入另一离心管中,加入0.1体积的10% CTAB 溶液,轻轻混合,重复c,d操作。

  e.加入等体积的1倍 CTAB 沉淀缓冲液轻轻混匀,室温下放置 30min 或更长。

  f.室温条件下,1500离心力离心10min,去上清液,沉淀纯化。

  (2)粗提物的纯化

  ①小量制备物的纯化

  试剂

  a.Imol/L NaCl。

  b.65%,80%无水乙醇。

  操作

  a.将沉淀溶于 400L 1mol/L NaCl 中可置56℃水浴中助溶。

  b.加入2倍体积的无水乙醇,于一70沉淀30min,或20℃过夜。

  c.15000r/min 离心2min。去上清液。

  d.先后用65%,80%乙醇,漂洗沉淀,吹干,溶于无菌蒸馏水中。

  ②大量制备物的纯化

  试剂

  a.1mol/L CsCl/EB溶液:50mmol/L Tris·Cl(pH8.0),10 mmol/L EDTA,1 mol/L CsCl,0.2mg/mL EB。

  b.7mol/L CSCl/EB 溶液:7mol/L CsCl,0.1%sarkosyl,0.2mg/mL EB。

  操作

  a.向沉淀加入 2.4mmol/L CsCl/EB 溶液,于56℃水浴中溶解。

  b.将溶液转入到 Beckman VTi65 超速离心管(或其他可替代的离心管)中,加入2.9mL7mol/L CsCl/EB 溶液,平衡,密封管口,轻轻倒置混合。

  c.用 VTi65 转子58000r/min 离心4h,或40000r/min 离心16h。

  d.320nm 紫外光照射下观察 DNA 的红色带,用16号针头的1mL 注射器从离心管侧面穿刺抽取 DNA。

  e.用 CsCl 饱和的异丙醇反复抽提 DNA,至抽提液无明显红色(去除EB)。

  f.将 DNA 样品置透析袋中,于4℃蒸馏水中透析24h,其间更换蒸馏水3~4次。

  g.透析液转入离心管中,加入1/10体积的3mol 二乙酸钠,及2倍体积的冷乙醇,混匀,于20℃沉淀过夜(或-70℃放置30min)。

  h.80000离心力离心15min,去上清液真空干燥 DNA 沉淀。用适量的 TE 溶解。


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