使用表面带电杂化(CSH)C18色谱柱提高反相肽分离的峰容量2
结果与讨论
肽分离
MassPREP肽混合物含有9种不同的肽，氨基酸组成、质量、长度和极性各有不同。肽序列如表1所示。由于该混合物由这样一组多样的肽组成，所以对于评价质谱性能和色谱性能是很有用的。鉴于此，相对于其他常用于肽分析的固定相，肽混合物被用作检测CSH130 C18的分离性能。本研究还包括用于高效分离混合物中大孔径肽(100 Å ~ 300 Å)的固定相，这些肽的分子量均低于 3kDa。另一个单独的应用纪要对使用130 Å孔径的CSH130 C18分离更大的多肽进行了讨论。11为了研究相关性，使混合物中每种肽的上样量与抗体肽图所用的常用条件接近，其中20 ~ 50 μg的Lys-C消化液或胰蛋白酶消化液一般在内径为2.0 mm或2.1 mm的色谱柱上进行分析。2,12-13同样，分离使用含有强离子对试剂TFA、较弱的离子对试剂FA或两者结合的流动相完成。肽反相分离通常与质谱联用，在各种条件下得到的性能颇引人注意。在这些应用中，因为甲酸能够提供灵敏度更高的检测，所以选用甲酸而非三氟乙酸作为流动相添加剂。14-15
图1是在不同的流动相条件下使用一根5 μm硅胶C18色谱柱得到的三张MassPREP的色谱图。使用TFA进行分离得到的色谱峰一般都是对称的。大部分色谱峰并未出现过度的峰展宽或拖尾的现象。但是，使用含有甲酸的流动相得到的峰形极不理想。此外，混合物中最大的肽——蜂毒素并未被检测出来，原因可能是峰过宽或根本没洗脱出来。对于使用HPLC进行的肽分离，这样的结果是很常见的。
使用亚2 μm颗粒可让肽分离的性能更加优越。在两种均以1.7 μm颗粒填充的色谱柱上得到的色谱图见图2和图3。特别是图2中的色谱图，它们使用表面多孔型C18色谱柱得到。在流动相中加入TFA时，得到的色谱峰是对称的，并且一般比使用5 μm多孔型C18色谱柱得到的色谱峰更窄，如图1所示。在流动相中加入极少量TFA或者不加TFA时，色谱峰变宽并出现明显拖尾。在所有测试条件下，全多孔BEH130 C18色谱柱分离的效果与表面多孔型C18色谱柱相当，如图3所示。
图1至图3表示的分离用于检测CSH130 C18,1.7 μm色谱柱肽分析的性能。对应的色谱图如图4所示。图1至图4的对比清楚表明，无论是使用含有TFA还是FA的流动相，与其他色谱柱不同的是，CSH130 C18都能够提供最佳的峰形。此外，可以明显看到，CSH130 C18 表现出独一无二的选择性——尤其使用不含TFA的流动相情况下。例如，在流动相中仅加入0.1%的甲酸，在本研究所用的其他任何色谱柱上(CSH130 C18除外)，肽8和肽9均未得到很好的分离。而使用CSH130 C18时，这两种洗脱是峰形对称并在3分钟以上的时间内分实现分离。另外，这些色谱柱之间也存在保留能力的差异。最值得注意的是，CSH130 C18色谱柱的保留能力稍弱于本研究涵盖的其他色谱柱。这正好印证了CSH130 C18是唯一一种表面带有少量正电荷吸附剂的事实。带正电荷的肽与CSH130 C18表面之间的库仑斥力很可能是CSH130 C18保留能力较低的原因。图4的插图显示了在CSH130 C18色谱柱上使用0.1%FA梯度时的最早洗脱部分。在这些条件下，亲水性最强的肽RASG-1(肽1)在孔隙体积标记附近出峰。与BEH130 C18色谱柱相比，一般使用CSH130 C18洗脱肽时所使用的ACN的量要少2% ~ 4%。 使用0.1%TFA时，保留能力的差异最小，而使用0.1%FA时，保留能力差异最大。分析极性很大的肽时，CSH130 C18的初始梯度条件可能需要作相应的调整。
峰容量和质谱信号
对这些定性分离的比较表明CSH130 C18比其他色谱柱具有性能上的优势。但是，定量更引人注目。在每个分离中观察到的峰容量按照实验部分的方法计算。图5A显示了在每种色谱柱上酸性改进剂组成与峰容量之间的关系。图5A的左部分是仅使用FA而不使用TFA离子对试剂得到的峰容量值。沿X轴向右是与FA浓度降低、TFA浓度升高时对应的峰容量值。CSH130
C18色谱柱的性能优势很容易显现出来。使用0.1%TFA时，CSH130 C18色谱柱的峰容量比其他1.7 μm C18色谱柱大20%。但是，如果使用含有0.1%甲酸的流动相，CSH130 C18色谱柱的峰容量比其他1.7 μm色谱柱大90%。因此，CSH130 C18不仅比其他色谱柱具有更大的峰容量，而且其性能对三氟乙酸的依赖性很小。由此带来的最明显效果是CSH130 C18色谱柱与质谱具有很高的兼容性。在这些分析中，三氟乙酸对肽质谱检测的影响见图5B。我们知道，在电喷雾离子化过程中，TFA会引起严重的离子抑制16-17。因此，使用TFA而不使用FA时，质谱信号降低12倍。CSH130 C18色谱柱并不需要太多TFA(如果有)来获得最佳峰容量，因此成为需要高灵敏度LC/MS应用的理想选择。
