BA-ot-ELISA法检测抗体形成细胞
【试剂及配制】
（1） 包被液（pH 9.6 碳酸盐缓冲液）
a2CO3 0.16g
aHCO3 0.29g
蒸馏水加至 100ml
（2） 洗涤液（pH 7.4 -Tween 20）
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H20 2.9g
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Tween 20 0.5ml
蒸馏水加至 1000ml
（3） 封闭液（1%A pH 9.6 碳酸盐缓冲液）
（4） 抗原
（5） BiO-Ab和Avi-HRP
【操作方法】
（1） 培养板的预处理：在24培养板孔内加0.5ml0.2%戊二醛（溶于0.1mol/L ，pH5.0 ），37℃，4h，甩去板中的处理液，洗涤3次，每次3min；
（2） 抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，-T洗涤3次，每次3min；
（3）
制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出脾脏，置于加有Hanks液的小平皿内，用钝头直角9号注射器针头破少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，1000r/min离心5min，Hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；
（4） 往各孔中加入0.5ml含不同浓度（104-106/ml）的细胞悬液，置37℃，5％CO2条件下孵育2-4h，甩去培养液，-T洗涤3次，每次3min；
（5） 往各孔中加入0.5ml生物素化抗体（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，甩去液体，-T洗涤3次，每次3min；
（6） 加入辣根过氧化物酶结合的亲合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，甩去液体，-T洗涤3次，每次3min；
（7） 配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mlTMB溶液（4mg/ml甲醇溶液）滴加入7.5ml10%明胶溶液（用pH5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制）边加边搅，溶液呈白色，加入14μl3%H202；
（8） 显色与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色斑点。
