病理制片技术——冷冻切片的制作
一、概述
冷冻切片是利用物理降温的方法将新鲜的组织标本冷冻使其产生一定的硬度进行切片的技术方法。与石蜡切片相比，由于冷冻切片不需脱水包埋因此制片速度
快，是为手术进行中的临床医师提供病理诊断的良好方法。此外由于冷冻切片的标本是未经固定的新鲜组织，因此冷冻切片也是脂肪染色、酶组织化学染色以及某些
免疫组织化学染色和原位分子杂交的理想制片方法。冷冻切片的不足是组织细胞的形态略逊于石蜡切片。
二、冷冻切片的制作方法
利用氯乙烷喷洒、二氧化碳喷射、半导体制冷的方法均可制作普通的冷冻切片，用于术中的病理诊断。恒冷箱冷冻切片机可以制作适用于各种目地的冷冻切片，是目前最为常用的理想冷冻切片制片方式。
1.冷冻切片的技术操作方法
(1)将恒冷箱冷冻切片机的速冻头和箱内温度调整到适宜的切温度，一般情况下为一18～一25℃。
(2)在标本冷冻托上涂布一层冷冻包埋剂一OCT，然后将取材后新鲜标本安放在标本冷冻托上并用OCT覆盖标本。
(3)标本冷冻完成后将标本托固定在切片机的机头上，调整机头位置使其恰好位于切片刀的后方。
(4)使用粗切削方式进行标本的粗切削至暴露标本的最大平面，使用自动推进方式连续切削2～3刀后用毛笔清除机头、标本托及切片刀上的组织碎屑。
(5)调整并确认切片的厚度，一般为4～8 um，染脂肪和神经组织应控制在12~25 um。
(6)放下防卷板使防卷板的位置恰好与切片刀的刀刃完全平行并略突出于刀刃。
(7)以自动推进的方式进行切片，良好的切片将在防卷板的下方形成一张完整平整的薄片，如切片略有弯曲可用小毛笔轻轻展平切片。
(8)打开防卷板，用载玻片平稳地轻压切片使其平整地吸附到载玻片上。
三、冷冻切片的染色
切好的冷冻切片立即投入丙酮中进行固定，一般固定1～2 min即可进行染色，用于免疫组化染色的冷冻切片应在切片略干时即刻投入冷甲醇中固定10~15 rmin然后进行相应的组织化学染色程序。
1．冷冻切片的HE染色程序。
(1)切片在丙酮中固定1～2 min。
(2)水洗5 s。
(3)使用新鲜的Harris苏木精染液染细胞核2min。
(4)水洗5 s。
(5)在0.5％的盐酸乙醇液中分化1～3 s。
(6)水洗5 s。
(7)在0.5％～1％的伊红染液中染细胞质20~30 s。
(8)水洗5 s。
(9)在95％乙醇I、95％乙醇Ⅱ、100％乙醇I、100％乙醇Ⅱ、中逐级脱水各3～5 s。
(10)甲苯I、二甲苯Ⅱ透明各5 s。
(11)干组织周围的二甲苯，在二甲苯尚未干燥前滴加光学树脂胶封片。
四、注意事项
1．提倡使用新鲜苏木精染色液：高质量的冷冻切片和良好的染色，是病理医师为在手术中的外科医师提供病理诊断的重要手段。为了在短时间内获得高质量的HE染色冷冻切片，在保证高质量冷冻切片的同时使用新鲜的苏木精染色液是保证高质量染色的重要前提。
2.防卷板的调整：正确地调整使用冷冻切片机的防卷曲板是获得平展完整冷冻切片的重要手段，防卷曲板的正确位置是与切片刀
的刀刃平行并略微突出于刀刃。如防卷曲板过度突出于刀刃会造成切片机头上的组织与防卷曲板相撞，如防卷曲板低于刀刃会造成切片向上卷曲不能形成平整的切
片。在调试时可从下向上逐步提高防卷曲板的位置，每提高一点切一张切片测试，直至切片能在防卷曲板下形成完整平展的切片。
正确位置 防卷曲板低于刀刃 防卷曲板过于突出
3.防止污染：切片污染是病理组织制片的大忌，在冷冻切片进行粗切削完毕后必须用毛笔清理碎屑，以防止其他标本的组织碎片沾染到正在进行切片的标本上。
4．不同组织的切片温度调整：不同组织冷冻切片的冷冻温度调整原则是，柔软稚嫩富含水分的组织选择相对较高的温度，较为致密富含脂肪的组织选择相对较低的
温度。柔软稚嫩富含水分的组织选择较低的温度易造成切片呈碎屑状，而致密富含脂肪的组织选择较高的温度易造成切片堆积不能形成片状。详见表9·1。
表9．1 部分组织冷冻切片的
| 冷冻温度 | 组织 |
| 一10～一15℃ | 淋巴结、肾上腺、脑组织、脾脏、子宫内膜、黏液软骨 |
| －16～一25℃ | 乳腺、肺、胆囊、子宫、小肠、结肠、肾、肝脏、肌肉、胰腺、前列腺、皮肤、甲状腺、扁桃体、软组织肿瘤 |
| 一25～一50℃ | 富于脂肪的乳腺组织、纤维脂肪组织、富于脂肪的皮肤组织、富于脂肪的肿瘤 |
