病理制片技术——常规染色
苏木精(hematoxylin)和伊(eosin)染色方法，简称HE染色方法，是生物学、细胞学与组织学最广泛应用的染色方法。在病理科称为常规染色 方法。病理学的诊断都是以HE方法为基础的。染色的目的是把组织切片或细胞涂片等浸入染料及其他染色剂配成的染色液中，经过适当的时间和处理，使组织或细 胞及其他成分染上不同深浅的颜色，产生不同的折射率，从而便于光学显微镜下进行观察和研究。
进行染色前进行染色液的配制，应根据工作量的多少配制相应量的染液，同时应注意溶液种类的选择、溶液浓度、pH值等，另外也应注意配方的合理选择。在实际工作中，应做到以下几点。
(1)保持染液的清洁，应经常过滤或更换。
(2)染色时间应根据组织的种类、染液的新旧及特殊要求而决定。
(3)染色环境温度对染色效果也有着密切的影响，故染色时间必须依据不同条件灵活掌握。
(4)脱蜡干净与否对染色效果有着重要影响，烤片温度、脱蜡二甲苯的温度、二甲苯的新旧和二甲苯脱蜡的时间长短都与染色有着密切关联。
(5)标本脱水的好坏及固定的充足与否对染色效果影响极大。
(6)切片染色后，经梯度乙醇脱水，若每步的时间不足易造成切片发雾、模糊不清，影响诊断。
在染色过程中，既要按常规方法步骤进行操作，也应根据实际情况、个人经验灵活运用，不断总结，才能熟练掌握并提高实际工作能力与效率。
一、人工染色
人工染色已使用近百年，至今还在使用，既古老又实用。人工染色的设置因地区的差异设置也不同，但大多数的地方基本一样。
１．石蜡切片HE人工染色程序(见表8．1)。
| 1 | 75℃恒温烤箱烤片20 min | |
| 2 | 二甲苯I | 2～5 min |
| 3 | 二甲苯Ⅱ | 2～5 min |
| 4 | 二甲苯Ⅲ | 2～5 min |
| 5 | 无水乙醇I | 1min |
| 6 | 无水乙醇Ⅱ | 1min |
| 7 | 95％乙醇I | 1min |
| 8 | 95％乙醇Ⅱ | 1min |
| 9 | 85%乙醇 | 1min |
| 10 | 80%乙醇 | 1min |
| 11 | 70%乙醇 | 1min |
| 12 | 自来水水洗3次，将水控净 | |
| 13 | 苏木精? | 5min |
| 14 | 自来水水洗3次 | |
| 15 | l％盐酸乙醇分化 | 3～5s |
| 16 | 自来水水洗3次 | |
| 17 | O．5％氨水返蓝 | |
| 18 | 自来水水洗3次 | |
| 19 | 1％伊红水溶液 | 1min |
| 20 | 自来水水洗3次 | |
| 21 | 70%乙醇 | 1min |
| 22 | 80%乙醇 | 1min |
| 23 | 95%乙醇I | 1min |
| 24 | 95%乙醇Ⅱ | 1min |
| 25 | 无水乙醇I | 1min |
| 26 | 无水乙醇Ⅱ | 1min |
| 27 | 无水乙醇Ⅲ | 1min |
| 28 | 二甲苯I | 1min |
| 29 | 二甲苯Ⅱ | 1min |
| 30 | 二甲苯Ⅲ | 搁置至封片 |
2．注意事项
(1)石蜡切片放入恒温箱中烤片，温度不可过低或过高，以75℃为宜，否则在染色过程中容易发生脱片。
(2)组织切片脱蜡要经二甲苯三次才能彻底。切片从恒温箱取出后应趁热浸入二甲苯以利于彻底脱蜡。使用一段时间后，第一缸二甲苯融的蜡较多应倒弃，其后的二甲苯依次前移，最后一缸换新鲜的二甲苯。
(3)切片经70％乙醇后入苏木精染液前，必须自来水水洗3次，最后1次最好用蒸馏水水洗并控干。这样可以保证Harris苏木精染色能力持久，而不会因为低浓度乙醇的混合而过早的丧失染色能力。
(4)Harris苏木精染液配制的好坏直接影响切片染色质量。好的苏木精染液500 ml正常染色能力为2500张左右。为保证染色质量应及时更换染液。
(5)苏木精染液要经常过滤以保证染色清洁而不在切片上有染色渣的出现。
(6)盐酸乙醇分化液配制参见本书第十二章。分化时间可根据分化液的新旧适当调整，新的分化液时间短些。分化的目的就是让该染上要清晰地染上，而不该着色的一定要分化掉。
(7)氨水返蓝液浓度不可过高，返蓝时间不可过高，不要过长，否则会发生脱片现象。
(8)1％伊红水溶液是理想的胞浆染液。要选择好水溶性的伊红染料使胞质鲜艳一些，切片不但漂亮且利于观片。
(9)切片染色后的脱水要充分，每道乙醇脱水的时间不要过短，尤其是三道无水乙醇更为如此。无水乙醇要勤更换。
(10)切片经最后一次无水乙醇后尽快地放人二甲苯中。在夏季室内湿度较大的环境中更是如此。如切片在湿度大的空气中停留时间过长就会在封片时产生雾气，
而不能现片。其原因是无水乙醇吸收了空气中的水汽，在二甲苯中难以分离析出，当用中性树胶封片后，二甲苯挥发，而水汽留在胶中产生雾气。
(11)封片所使盖玻片需大小合适、清洁。树胶用量视盖玻片大小而定，要求不发生溢胶或缺如。
(12)不提倡切片经无水乙醇，然后干燥，直接用中性树胶封固。这样会产生人为的细小黑点，与细胞核相似。
(13)封片要在通风厨中进行，防止二甲苯污染工作间，危害技师的身体。
二、自动染色机
自动染色机是近几年才引进的病理自动仪器，在病理制片过程中发挥着重要的作用，它可以连续进行染色，自动记忆，染色效果好，质量控制到位。起到了手工无法比拟的作用。
1．液体设置：由于机器为电脑控制，染液顺序及液体的设置根据染色机所设置的染色缸多少来调配。染色机基本模拟手工方法，利用机器手来完成操作程序见表8．2。
| 二甲苯 | 二甲苯 | 二甲苯 | 无水乙醇 | 无水乙醇 | 95%乙醇 | 85%乙醇 | 水 | 水 | 水 | 水 | 水 | 烤箱65℃ |
| 停机报警取篮处 | 二甲苯 | 二甲苯 | 二甲苯 | 无水乙醇 | 无水乙醇 | 95%乙醇 | 85%乙醇 | 伊红 | 1% 氨水 | 1% 盐酸乙醇 | 苏木精 | 装机 |
2．注意事项
(1)工作前先检查染液及试剂，并开启电源。
(2)开启进水开关。
(3)调试好所需的染色程序，根据苏木精一伊红的新旧来调整时间。
(4)将切片染色篮放人染色机后按提示键即可按程序进行染色。
(5)听到提示音响后，取出已染好的切片染色篮进行封片。
(6)工作完成后，关闭电源，关掉水源，并盖好染色缸。
(7)染色机配制的无水乙醇及95％乙醇的程序比手工程序少，但不影响染色效果，因机械手在提升时有抖动作用，带的液体很少。
(8)定期取出活性碳过滤网晾晒保证使用。
(9)工作结束后一定要取出盐酸乙醇，以免长期放在机器内，腐蚀机器。
