美拉沙星：一个可以高效抑制读码框移位的小分子化合物
新冠肺炎（coronavirus disease 2019， COVID-19）自2019年底爆发以来肆虐全球，严重威胁着人们的生命健康和日常生活，也给许多国家的经济带来沉重打击。同时，全球科学家的目光也空前聚焦于新冠病毒（SARS-CoV-2）与新冠肺炎的研究，以期通过科学的力量帮助人类战胜这一挑战。目前，为治疗丙型肝炎和埃博拉病毒感染研制开发的Remdesivir是唯一经FDA批准的用于治疗新冠肺炎的抗病毒药物。结合2003年的非典（SARS）以及2012年的中东呼吸综合征（MERS）的爆发来看，冠状病毒引发的瘟疫呈现出越来越频繁的趋势。因此，研制强有力的抗病毒备选药物对于应对当前疫情以及将来可能发生的冠状病毒感染来说都是十分重要的。
SARS-CoV-2是一种正链RNA病毒，基因组RNA全长约3万核苷酸，属于冠状病毒科，与非典病毒（SARS-CoV）和MERS病毒 (MERS-CoV) 同属于beta冠状病毒属。SARS-CoV-2进入人体细胞后，首先需要对其最长的一个开放读码框ORF1ab进行翻译，生成一个大型融合蛋白。然后，在病毒蛋白水解酶的作用下，融合蛋白被切割成16个病毒复制所需要的酶。实际上，ORF1ab由ORF1a和ORF1b两部分组成，ORF1b位于ORF1a的−1读码框。ORF1ab融合蛋白的翻译过程中存在一个非常特殊的现象：程序性核糖体−1读码框移位（programmed −1 ribosomal frameshifting，−1PRF）。当翻译进行到邻近ORF1a末端时，一部分核糖体会向5′端移动一个核苷酸的位置, 重新定位于−1读码框并接着翻译ORF1b，从而避开ORF1a末尾的终止密码子。
许多研究表明，这种核糖体移位现象是由病毒RNA的特殊二级结构介导的。在病毒RNA上ORF1a和ORF1b的交接处，存在一个读码框移位激活元件（frameshifting stimulatory element，FSE）。FSE主要分两部分：一个包含7个核苷酸的滑动序列（slippery sequence）和一个由3个茎结构组成的RNA假结（pseudoknot）。在翻译过程中，pseudoknot使得病毒RNA与配位tRNA之间产生张力，从而使tRNA与核糖体在滑动序列处向上游移动一个核苷酸，重新配位于−1读码框。
这种翻译过程中的核糖体移位决定了ORF1b上诸多基因的表达，对于新冠病毒的复制至关重要。不仅仅局限于新冠病毒，所有冠状病毒以及另外许多RNA病毒的蛋白质翻译都需要读码框移位的参与。与此相对，这种现象在人类自身基因的表达过程中极为罕见，使其可以作为一个良好的药物靶点。
近日，耶鲁大学医学院郭俊傑博士团队等在PNAS上发表文章Restriction of SARS-CoV-2 replication by targeting programmed −1 ribosomal frameshifting，运用荧光蛋白报告基因系统联合高通量筛选技术，鉴定出了一个可以高效抑制读码框移位的小分子化合物美拉沙星（merafloxacin）。
研究者们首先设计了一个报告基因系统，用于在非病毒感染的条件下指示读码框移位效率。在此报告基因载体中，SARS-CoV-2 FSE被放置于0位的mCherry基因和−1位的GFP基因之间。将载体转染到HEK293T细胞中后，研究者通过观测GFP相对于mCherry的荧光强度来计算读码框移位的效率。
在耶鲁大学分子探索中心高通量自动加样器的帮助下，研究者使用上述系统对一个包含4400多个化合物的小分子文库进行了筛选，寻找能显著影响读码框移位效率的化合物。通过对得到的备选化合物进行验证，研究者最终证明merafloxacin能够显著抑制SARS-CoV-2报告基因系统的读码框移位。除了SARS-CoV-2外，merafloxacin对beta冠状病毒属的读码框移位均具有显著的抑制作用，相反，对alpha和gamma冠状病毒属的-1PRF则效果较弱。另外，研究者们还检测了已知SARS-CoV-2突变株在FSE区域的变异，发现merafloxacin对突变FSE仍然具有显著的抑制效果。以上研究结果表明，merafloxacin特异性抑制beta冠状病毒的读码框移位，并且这种抑制作用不受FSE轻度变异的影响。
为了观察merafloxacin对病毒复制的干扰效应，研究者将不同浓度的merafloxacin加入感染了SARS-CoV-2的猴肾脏上皮细胞Vero-E6，并检测感染48小时后的病毒滴度。研究发现，merafloxacin能显著抑制病毒复制，其半数效应浓度（EC50）约为2.6µM。同时，通过对比读码框移位的效率与病毒滴度的增长率发现，读码框移位效率是制约SARS-CoV-2病毒增值的限速因子， 进一步表明读码框移位作为药物靶点的重要性。
此项研究由耶鲁大学医学院神经科学系郭俊傑博士研究组主导，由来自多个院系的实验室合作完成，它们包括耶鲁分子探索中心Yulia Surovtseva研究组、微生物病原系Brett Lindenbach 和 Ya-Chi Ho 实验室、分子生物物理与生物化学系Wendy Gilbert实验室以及实验医学系Craig Wilen实验室。郭俊傑实验室的博士后孙玉博士为第一作者。
目前，merafloxacin抑制读码框移位的机制还不清楚。研究者推测merafloxacin可能直接作用于核糖体与病毒RNA的结合，或者抑制某一内源性调控蛋白。由于merafloxacin的天然靶标是细菌拓扑异构酶，那么它们在真核生物中的同源基因是否参与读码框移位的调控是值得进一步研究的方向。Merafloxacin的发现揭示了靶向读码框移位是一个可行且高效的抗病毒策略，适用于包括SARS-CoV-2在内的许多冠状病毒。研究者希望通过对merafloxacin的分子结构进行优化，提高其抗病毒活性，从而使其成为一个强效的抗病毒备选药物。
