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农业领域中的应用-高分辨熔解曲线分析技术

2020.7.20

高分辨熔解曲线分析技术（High Resolution Melting Curves Analysis）是近年来发展起来的一种检测基因突变和刷选SNP的新方法。这种方法也可以与标记和非标记探针结合对已知位点的突变和SNP进行检测以及用于SSR（STR）等短串联重复分子标记分析。

该技术已经被大规模应用于医学领域中，用来分析和筛选导致人类疾病的基因的突变研究。一系列的研究证明，高分辨熔解曲线分析技术是筛选SNP和进行基因分型工作的迅速、廉价而有效的方法。

目前，高分辨熔解曲线分析技术开始越来越多的被应用在农业领域的研究中，并且取得不少成绩。其中比较有代表性的研究单位有英国洛桑农业试验站、中国科学院发育与遗传研究所、中国农业科学院植物保护研究所、中国林业研究院热带林业研究所等。

下面，简单介绍一下高分辨熔解曲线在农业领域中的应用。

小麦是世界上普遍种植的粮食作物，对人类的可持续发展有重要的影响。英国环境、食品和农业事务部小麦遗传改良工作组(Defra Wheat Genetic Improvement Network)与英国洛桑农业试验站合作建立了采用高分辨熔解曲线进行基因突变分析的研究平台。研究者采用化学诱变剂甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)对春小麦进行诱变，然后采用高分辨熔解曲线分析的方法(LightScanner™ 系统和LCGreen Plus染料)对处理后的样品进行扫描，证明这种方法在研究小片段的基因靶序列时有很高的灵敏度与成功率，并且在研究那些外显子较小而内含子很大的基因时特别有效。

下图为采用LightScanner系统和LCGreen染料对EMS诱变后的春小麦进行的高分辨熔解曲线分析。

图1. GA20ox1D中的高分辨熔解曲线进行的突变扫描。野生型的小扩增片段为灰色，可能的突变体用红色显示。

大麦轻性花叶病毒（BaMMV）和大麦黄色花叶病毒（BaYMV）可以导致大麦的黄花叶病，严重影响大麦的产量。隐形等位基因rym4和rym5对BaMMV和BaYMV有抗性，在欧洲被用在大麦的育种工作中。英国洛桑农业试验站最近发现rym4和rym5以及rym6与真核转录起始因子4E（eIF4E）的突变等位基因相当。对植物的eIF4E基因及其亚型eIF(iso)4E的研究有助于了解抗病机制。洛桑农业试验站的研究者们在世界范围内收集大麦主要种植地的大麦样品，采用基于cDNA的高分辨熔解曲线分析的方法(cDNA-based high-resolution melting）对其中1100个样品的eIF4E基因进行突变筛查。英国洛桑农业试验站采用这种高通量低成本的研究方法扫描了eIF4E基因编码序列的突变位点，对含有突变的基因进行了测序，成功的鉴定出了大于30个不同的eIF4E等位基因的突变，大大节省了测序工作的成本和精力。

下图为英国洛桑农业实验站采用LightScanner仪器对不同样品中eIF4E基因的高分辨熔解曲线的分析结果。其中，蓝色和红色的曲线所代表的样品均为突变型，灰色的为野生型样品。

图2. 采用高分辨熔解曲线(LightScanner™ system; Idaho Technology Inc.)对eIF4E的突变等位基因进行筛选。

多倍体植物因其基因的多拷贝，一个等位基因上隐性突变所造成的影响常被其他同源拷贝所弥补；另外，多拷贝基因也常常给测序工作带来麻烦，这些原因使得研究多倍体作物更为困难。采用混合样品的高分辨熔解曲线分析的方法常常对突变检测和基因型研究有意想不到的效果。基本原理是同一个SNP位置上两个不同的纯和突变子通过混合会产生一个类似杂合子的熔解曲线。如果是两个相同的基因型的样品，则混合后产生的熔解曲线不会发生变化。中科院遗传所的中科院某实验室采用该方法对小麦亲本的基因型进行分析。中科院某实验室将两个亲本中的任意一株的熔解曲线与子一代的熔解曲线进行比较，如果两条熔解曲线相同则证明两株亲本样品的基因型一样。如果不同，则证明两株亲本样品基因型不同。这种方法快速而有效的帮助中科院某实验室解决了如何确定亲本的基因型是否相同的问题。

下图为中科院某实验室采用LightScanner系统对已知的亲本样品和子一代的熔解曲线进行的验证实验。

图3-A不同基因型的亲本和子一代的熔解曲线。红色的曲线和灰色的曲线代表的样品被LightScanner认为是野生型和突变。

图3-B 相同基因型的亲本和子一代的熔解曲线。亲本和子一代被LightScanner认为均属野生型样本。

图3-A中的两个亲本样品的基因型是不同的。将子一代与亲本样品的PCR产物在LightScanner系统上进行高分辨熔解曲线分析，被LightScanner系统认为是野生型和突变型，表明两个亲本的基因型不同。图3-B中的两个亲本样品的基因型相同，将子一代与亲本样品的PCR产物在LightScanner系统上进行高分辨熔解曲线分析，被LightScanner系统认为均是野生型，表明两个亲本的基因型相同。该方法在研究多倍体细胞时，可以快速简便的鉴定样品的基因型是否相同。

随着测序技术与生物信息技术的发展，各种模式生物的基因组信息越来越完善，其他物种的基因组也在不断的被测序。但是，可以想象，地球上的生物种类如此丰富，不可能对每个物种的基因组都进行测序。因此，在研究那些基因组信息不全的物种时就会给研究带来不少麻烦。澳大利亚新英格兰大学采用高分辨熔解曲线与EST数据库相结合的方法来研究整个杏树基因组中的SNPs。他们从NCBI Genebank中的EST数据库中得到3864 条杏树的EST序列，同时结合杏树和桃树的SNP数据库来筛选潜在的SNP。然后通过高分辨熔解曲线分析的方法对25个杏树变种中推测的SNP进行筛选与验证。结果发现杏树中SNP的发生频率为1：114bp，转换与颠换的比例为1.16：1；同时证明高分辨熔解曲线分析方法是筛选SNP和进行基因分型工作的快速有效且成本低廉的研究方法，并且特别适合于研究基因组信息很少的生物。
下图为澳大利亚的研究者对两个不同的小的扩增片段进行的高分辨熔解曲线的分析。