生物大分子药物代谢消除途径及体外代谢研究方法进展
摘要
由于理化及生物学性质的差异，生物大分子药物与传统小分子药物相比，药代动力学机制更加复杂，在体内表现出不同的吸收、分布、代谢、排泄过程。
大分子药物一般不经CYP 450 酶代谢，其体内消除途径主要有肾小球滤过、酶水解、受体介导的胞吞消除和抗药物抗体介导的消除。
近年来，除了常用的免疫分析法、放射性同位素示踪法、LC-MS/MS 等分析方法外， 还有计算机模型被开发用于模拟预测大分子药物药代动力学性质的研究并发挥越加重要的作用。
本文主要综述了大分子药物主要代谢消除途径及体外研究模型TMDD、PBPK 的应用和发展。
正文
随着生物技术的迅猛发展，生物大分子药物已被广泛用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病和代谢性疾病等多种疾病。
与传统小分子药相比，生物大分子药物具有分子量和流体半径大，亲水性好，稳定性差等理化性质，且与人体内源性蛋白组成结构类似的特点，决定了其特有的复杂的药物代谢动力学特征（见表1），这增加了该类药物的检测难度。
由于缺乏高灵敏度和特异性的适用于大分子药物的检测方法，给研究者在临床前对其药动学带来了诸多困难。而在药物研发早期阶段就评估候选分子代谢性质有助于提高研发成功率，减少药物开发成本。
基于此，综合大分子药物的体内主要代谢途径、建立体外预测其药物代谢动力学（PK）特性的预测模型，并将其应用于大分子药物早期研究阶段显得尤为重要。
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生物大分子药物主要代谢消除途径
蛋白质、多肽类药物由氨基酸组成，与传统化学小分子药物相比，具有分子量大、结构复杂、稳定性差等特点，给临床前药动学研究带来了诸多困难。
生物大分子药物代谢消除途径主要有肾小球滤过、酶水解、受体介导的胞吞消除和抗药物抗体介导的消除。
1.1 肾小球滤过
药物分子的大小， 形状和电荷均会影响肾小球滤过，分子量较大的药物通常不会被肾小球滤过，而对于分子量小于肾小球滤过阈值（60 kDa）的治疗性蛋白，该消除途径的作用不容忽视。
重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）已被广泛用于骨髓移植和肿瘤治疗， 然而天然和重组G-CSF 易被肾小球滤过且存在酶降解，因而血浆半衰期较短。
研究者对GCSF融合人血清白蛋白第三结构域，一方面通过增大其流体半径而降低肾小球滤过，另一方面可通过与FcRn 结合而避免酶降解，使得该融合蛋白的循环半衰期约延长为原型的2倍，提供了具有潜在应用价值的创新药物分子。
相较于带负电荷的分子， 中性或带正电荷的分子更容易通过肾小球屏障，例如带负电荷的白蛋白比同等大小乃至分子更大的含中性葡聚糖的蛋白更不易通过肾小球屏障。
1.2 酶水解代谢
人体中存在多种蛋白水解酶， 所以酶水解作用在蛋白类药物代谢中也非常重要。胰高血糖素样肽1（GLP-1）是葡萄糖依赖的肠降血糖素，具有良好的降血糖活性，但其在血清中易被二肽基肽酶IV（DPPIV）降解失活，致使其半衰期不足2 min，严重阻碍了其临床应用。
GLP-1 天然类似物艾塞那肽（Exendin-4）不易被DPPIV 降解，稳定性有所改善，半衰期为2.5 h，成为首个获批的GLP-1 类似物。此外，新型GLP-1类似物索玛鲁泰通过对氨基酸序列优化，增加了其对DPPIV的稳定性，半衰期延长至168 h，大大增加了患者依从性。
转移抑素是由54 个氨基酸组成的多肽， 其截断型转移抑素（45~54）体外活性是原型转移抑素的3~10 倍，但这两种多肽都对代谢酶敏感，可在小鼠血浆中被迅速代谢。
ASAMI 等通过对转移抑素改构，大大提高了其代谢稳定性，改构后的分子对胰凝乳蛋白酶、脑啡肽酶和基质金属蛋白酶9 等血浆蛋白酶具有抗性。应用动力学模型分析改构后的类似物在人血清中的半衰期，结果表明半衰期大大延长。
在生物药物研发早期，考虑酶水解造成的肽和蛋白质降解对分子代谢性质的影响， 并通过给予酶抑制剂或对水解酶易感部位进行改构，可以延长其半衰期。
1.3 受体介导的胞吞消除
参与细胞内吞作用的受体包括大分子药物的靶受体以及除靶受体以外的消除型受体，后者包含糖蛋白受体、Fc 受体和FcRn 受体。
1.3.1 靶受体介导的消除
蛋白质药物靶点明确， 特异性高，其发挥药效会选择性的作用于其专一性靶点，即靶受体。
靶受体与蛋白质药物结合后，通常会携带已经结合的蛋白质药物内化进入细胞， 并介导蛋白质药物的胞内降解过程。因此，靶受体的作用不仅与其药效学紧密相关，同时也会显著影响蛋白质药物消除过程。
靶受体介导的消除作用的大小取决于蛋白质对其靶受体的亲和力、靶受体表达水平、靶受体的内化率以及治疗性蛋白质的给药浓度和靶细胞内的分解代谢速率。
通常情况下，当治疗药物浓度低，靶受体浓度和内化率高时， 且蛋白质治疗剂与靶受体间的亲和力非常高时，靶受体介导的消除作用更显著。另外，靶受体介导的消除不仅发生于表达在细胞膜表面的靶受体，也发生在可溶性受体。并且与组织细胞上表达的靶受体相比，在血液中表达的靶受体一般对蛋白质药物消除的影响更显着。
可溶性靶受体与两个或多个抗体结合可导致吞噬作用并介导mAb 的快速消除。利妥昔单抗是一种抗CD20 单克隆抗体，被批准用于慢性淋巴细胞白血病患者的一线治疗，其药代动力学表现出时间依赖性，这可能与靶受体数目随着时间变化有关。
利妥昔单抗在循环B 细胞上的CD20 数目较多的患者体内表现出靶受体介导的消除速率更快。此外，关于利妥昔单抗多剂量研究报道，随着输注次数的增加，其消除率随之降低，这可能是由于利妥昔单抗治疗后靶细胞数量减少，导致靶受体介导的消除作用下降所致。
由于靶受体数量有限，该消除途径通常是可饱和的，因此， 该途径也是大分子药物非线性PK 特性的重要原因之一，且生物药物发挥药效也会使得靶受体数目改变，进一步改变靶受体介导的药物消除速率。
因此，在设计下一代生物大分子药物时，需在研发的早期对靶受体介导的消除作用进行研究，以避免临床上因该消除途径导致的分子吸收和生物利用度差、而造成不必要的失败。
1.3.2 Fc 受体介导的消除
FcγRs 通常表达于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等各种免疫细胞表面，可识别生物分子Fc 区域，并介导其内化及随后的细胞内分解代谢。
Fc 受体不仅可介导内源性IgG 的消除，也可以介导外源性治疗性蛋白的消除， 因此该途径为非特异性消除途径。
Fc 受体参与Fc融合蛋白、抗体类药物和可溶性药物-靶复合物的胞吞消除过程。目前，对FcγRs 介导的消除的意义和确切机制尚未研究透彻。
Kasturirangan S 等设计的靶向可溶性IL-6 上不同表位的双特异性抗体，以阻断IL-6 介导的信号。
该抗体由于可以结合抗原不同表位，形成更复杂免疫复合物，相较于含有单个抗原抗体的免疫复合物， 这些复合物能更快速结合FcγRs 并诱导吞噬和降解， 促使抗原被迅速中和消除的同时，不可避免也会影响抗体的PK。但是，有研究表明，FcγR介导的消除对于mAb 可能仅起很小的作用。
综上，FcγRs介导的消除作用对于靶向可溶性抗原和细胞表面抗原的影响有所区别。
1.3.3 糖受体介导的消除
糖蛋白受体介导的生物大分子消除主要有两条途径：去唾液酸糖蛋白受体（Asialoglycoprotein Receptor，ASGPR） 介导的消除和甘露糖受体（Mannose Receptor，MR） 介导的消除。
ASGPR 主要表达在肝窦状间隙的肝实质细胞表面， 可识别糖链末端的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基而介导糖蛋白被肝细胞内吞降解，在糖蛋白代谢中发挥重要作用。
本课题组前期研究表明，相较于唾液酸含量高的对照糖蛋白药物，低唾液酸含量的凝血因子VII 和帕妥珠单克隆抗体均由于ASGPR 亲和力更高， 而被肝细胞内吞消除更明显，体内半衰期也相应较短。
甘露糖受体主要表达在巨噬细胞和树突状细胞的细胞膜表面，可识别糖链末端的甘露糖和N-乙酰葡萄糖胺残基而介导糖蛋白消除。末端为Man5 聚糖的IgG 消除率明显快于具有更复杂糖基化的蛋白药物。
Liu L 等的研究表明，毕赤酵母表达的融合蛋白倾向产生高甘露糖型， 且该糖型的Fc 融合蛋白会被高表达甘露糖受体的肝脏窦内皮细胞结合而快速消除。
尽管目前已研究了很多糖基化对于糖蛋白代谢的影响，但并没有形成完全一致的结论。研究者可以参考现有的研究成果，在新药研发中，对糖基化加以重视，并建立相应的研究方法评估糖受体对目的分子代谢影响，于研发早期规避代谢性质差的分子。
1.3.4 新生儿Fc 受体（FcRn）介导的转胞吞作用
FcRn 受
