生物大分子的离心分离实验（一）
一、引言
在八十年代以前，生物大分子（特别是核酸、蛋白）用离心方法分离纯化占有很重要的地位。用分析超离心方法测定生物大分子的分子量、沉降系数、扩散系数、微分比容等在生物化学实验中也占有一席之地。八十年代以后，由于离心技术的快速发展（微处理器的引入，变频驱动的完善、转速的提高等等），先进的制备用超速离心机已经能够替代昂贵的分析机型完成M.S.D 等参数的测定。分析超速离心机在实验离心技术领域转向与其他实验技术（如NMR，x 衍射等）结合研究生物大分子的结构功能。
进入九十年代，电泳技术的发展使得原来用离心技术来测定生物大分子分子量的方法又变得落后了。用电泳技术测定分子量M.方法简单、快速、成本较低（文献2， 3）。而近年来用核酸与蛋白的快速测序方法来测定生物大分子的一些参数，比用离心法、电泳法更先进，精度更高。（文献4，5）
尽管如此，离心分离方法还是以它的部分优势存在着：分离范围广，容量大；可以研究天然生物大分子的流体动力学特性；可以在电离介质中进行生物大分子的片段分离；对缓冲剂限制很小（在电泳技术中由于电流的热效应而限制了缓冲剂的使用）等等。另外在各种实验方法的前处理阶段，离心法还是被广泛的使用着。考虑到各个研究部门的设备分布情况，在很多条件下，离心分离的使用还具有相当的广泛性。作为有效的分离纯化方法，差分离心、速率区带密度梯度离心和等密度离心在生物大分子的研究中还占有重要地位（文献1）。
二、生物大分子的离心分离要点：
（1） 防止污染：
要避免在实验过程中由于生物大分子部分受损而引起降解或变性，引起降解的原因很多，如实验过程中的外力作用；某些酶污染等等，但最常见的原因是酶的作用。
实验过程中由于污染某些脱氢酶进入样品而使生物大分子变性。
避免的方法：
（i）用抑制剂来降低脱氢酶的作用：常用的抑制剂有DFD（二异丙基磷酸氟）、PMSF（苯甲基磺酰氟）、EDTA（1~10mM ）、SDS（0.1~1% ）、DEPC（焦碳酸二丁酯）（0.1%）……。
（ii）对所有接触样品的容器（离心管、管盖组件、移液器、移液管等等）进行彻底消毒（蒸汽消毒或0.1%DEPC 侵泡）。
（iii ）由于实验人员皮肤表面有酶存在，所有实验必须使用经过消毒的手套操作。
（iv）合适的PH 值：过度的酸碱度也会使生物大分子降解。
（2） 避免变性的其他注意事项：
（i）转头在离心前预冷到接近离心温度（在冰箱中放置过夜，或在恒温箱中保温）。对于超速离心机，其制冷系统主要用于抵消转头在稀薄空气中高速运转（转头表面线速度从亚因速—>超因速）时气动力摩擦产生的热量。在真空中，只有辐射传热的情况下，高速运转的转头温度从室温（如夏天30~35℃）降到5℃时间很长（如1 小时左右）一般应预冷到接近离心温度（±2℃）以确保在离心的最初阶段（15 分钟以内）转头温度和样品温度一致。
（ii）用固定角式或近垂直管转头或垂直管转头作梯度离心时必须利用离心机的慢加速（0~500rpm ）、慢减速（500rpm~0）功能，以保证梯度方向的顺利转换。
（iii）离心开始、离心结束都要小心地轻放和轻取离心管，避免大的震动。
（iv）卸样过程应在无震动的实验台上进行，环境温度和离心温度相近，卸样方法应选择平稳、外力作用很小的方式，尽可能不用泵输送样品。
（3） 有关梯度离心的其他要点：请参照文献（8）（9），本文略。
（三）生物大分子的离心分离实例：
例（1）去蛋白的RNA 分离：
（i） 样品匀浆加入9 倍容积的冰冷20mM Tris-HCl（ PH8.0 ） 1mMEDTA 。
（ii） 加入1/10 容积的10% SDS，再加入等容积的（苯酚：氯仿：异丙醇）（容积比50：50：2）溶液并含有0.1% 的8-羟基喹啉溶液充分混合使其乳化。
（iii） 以上溶液在10,000xg 离心10 分钟。
（iv） 移出上清液，重复（ii）（iii）过程一次。
（v） 第二次离心后上清液中加入1/10 容积的3M 醋酸铵，充分混合后再加入二倍容积的乙醇，并在-20℃静置二小时以上。
（vi） 10,000xg 5℃离心10 分钟得到RNA 沉淀。
（vii） 用干燥的N2 气体蒸发掉沉淀中残留的乙醇。
（viii） 将RNA 溶于20mMTris-HCl（PH8.0），1mMEDTA 中，-20℃低温保存待用。
例（2）从大肠杆菌中分离质粒DNA：
（i） 溶液制备：
溶液I：50mM 葡萄糖，10mM（EDTA），25mM Tris-HCl（PH8.0）
溶液II：0.2M NaOH，1% SDS
溶液III：3M 醋酸纳（PH4.8）
TE 缓冲液：10mMTris-HCl（PH7.4），2mM EDTA
（ii）E. Coli 培养液1 升（量大按比例配置）
（iii）将1 升培养液在4,000rpm（约2,000xg），5℃离心20 分钟，得到细菌沉淀。
（iv）用100ml 冰冷的溶液I“洗”沉淀，再次离心，4,000rpm，5℃， 20 分。
（v）用20ml 冰冷溶液I 将第二次离心沉淀调成均匀悬浮液。
（vi）每ml 悬浮液加入2mg 溶菌酶，并在0℃冰浴中放置10 分钟。
（vii）加入40ml 溶液II，轻轻搅拌后，在冰浴中放置5 分钟。
（viii）加入30ml 溶液III，在冰浴中放置20 分钟，使蛋白质大部分沉降。
（ix）在高速冷冻离心机上用角式转头，10,000rpm（约10,000xg ）离心15 分钟，5℃。
（x）小心地倒去上清（不扰动沉淀），在沉淀中加入55ml 异丙醇， 即得到粗制的质粒DNA 溶液。
（xi）粗制DNA 液在-20℃静置15 分钟以上，再在12,000rpm（约15,000xg）4℃离心5 分钟，倒去上清液。
（xii）真空中抽去异丙醇，沉淀中加入18ml 经过消毒的TE 缓冲液， 在沉淀溶解后再加入0.65ml，1% E.B.
（xiii ）以上溶液每ml 加入分析纯CsCl 1 克，使其完全溶解，检测溶液折射率应为1.3890（密度≈1.587）
（xiv ）用以上溶液按照参考文献（6）所介绍的方法作质粒DNA 分离。
（xv）离心后在300nm 紫外光下可显示DNA 带（线性DNA 带和质粒DNA 带，RNA 沉淀在底部，蛋白质浮在液面）。
（xvi）用文献（1）介绍的方法取出质粒DNA，抽提去掉E.B. 透析法或脱盐柱去除CsCl 。
