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阳性重组克隆的构建和筛选

2019.4.18

实验概要

构建并筛选含有目的基因的候选阳性重组克隆。有助于理解目的基因与克隆载体的连接、转化和筛选原理及流程。

实验原理

1. 连接反应：利用经过限制性内切酶消化的线形载体与目的基因两端暴露出的平末端或相同的粘性末端，使用T4 DNA 聚合酶将二者连接起来形成重组载体。
2. 转化过程：感受态细胞通过温度敏感性摄入重组载体，并在含有抗生素的LB琼脂平板培养基上进行表达及扩增形成单一克隆。
3. 菌落PCR：以单一菌落为模板进行PCR 扩增，获得含有目的基因的候选阳性重组克隆。

克隆原理示意图

主要试剂

1. 连接反应试剂盒
2. 感受态细胞E. coli JM109
3. SOC 培养基（每升含有胰蛋白胨20 g，酵母提取物5 g，NaCl 0.5 g，1 M葡萄糖20 ml）
4. 含有抗生素（Kanamycin，终浓度50 μg/ml 或Ampicillin，终浓度100 μg/ml）的LB 琼脂平板培养基（每升含有胰蛋白胨10 g，酵母菌提取物5 g，NaCl 5 g，1M NaOH 1 ml）
5. PCR 反应体系

主要设备

1. 电热恒温水槽
2. 水平振荡摇床
3. 细菌培养箱
4. PCR 扩增仪
5. 电泳仪及水平电泳槽
6. 凝胶自动成像分析系统

实验材料

目的基因和载体片段

实验步骤

1. 连接反应

37℃水浴孵育2 h 或16℃过夜。
2. 重组载体DNA 的转化
   1) 取感受态细胞E.coli JM109 60 μl 于灭菌的1.5 ml Eppendorf 管中，加入5 μl 连接产物，轻轻旋转混合内容物，于冰中放置30 min；
   2) 42℃中放置45 sec 后立即放入冰中；
   3) 3 min 后加入37℃预热的SOC 培养基940 μl，37℃ 225 rpm 振荡培养1 h；
   4) 取50 μl 转化物涂布于含抗生素的LB 琼脂平板培养基1 ml 中，37℃培养过夜。
3. 菌落PCR 鉴定重组阳性克隆在生长的菌落中，随机各挑取5～10 个独立圆滑的菌落，通过PCR 的方法对重组载体进行筛选。
反应体系：

反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 sec、68℃ 3 min、25 cycles，68℃ 5 min。
PCR 产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测确定阳性克隆并照相。