菌落pcr步骤
一、引言
常规的PCR扩增需要进行细菌培养、质粒制备等多步操作后才能进行基因扩增,操作繁琐耗时较长,同时在反复的操作中DNA量损失也较大,产率较低。在1989年 Gussow Clackson3建立了菌落PCR( colony PCR)法,菌落PR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于,直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落,操作简单,快速,在转化鉴定中较常用。
二、原理
常规的PCR需要专门制备DNA模板,面菌落PCR可直接以单个菌落作为模板,用无菌牙挑取单个菌落到TE级冲液中,煮沸10mn,涡旋振荡后短暂离心,用1-2pl裂解液作为DNA模板,省去抽提模板DNA这一步,通过特异性引物或通用引物对目的基因进行快速扩增大大节约了时间和成本
三、材料
1.固体平板培养基上培养出的单菌落
②10XPCR缓冲液(100mmol/ L. Tris-HCL, pH8.3,500 mmol/L KCL;0.1%明胶;15mmol/LMgCl2)。
③目的基因引物
④高压灭菌牙签
⑤抗性平板。
⑥ Triton x100
7.EP管
8.离心机
四、操作方法
①用高压灭菌的牙签挑取单个菌落,先在含抗性的平板上画线,做保种用,然后将牙签置于2 Intar×100中搅和一下,以便悬浮涂在牙签上的菌,将相应的菌和平板上的画线区做上对应的②将装有20 u Triton×100的EP管煮沸10min,冷却后120r/min离心lmin去除细胞
③反应体系(25ul)
Taq酶(5U/ul） 0.5ul 引物P2(10umol/L） 0.5ul
10×Taq缓冲液 2. 5ul dNTPs(各 2. 5mmol/L) 2ul
模板
引物Pl(10mo/L) 0.5ul
④PR扩增条件:95℃ 5min 94℃ 30s, 55℃ 30s,72℃ 60s,30循环;72℃5min;4℃
⑤电泳,观察结果,对阳性的结果相对应的主平板上的菌落保种或者进行测序。
五、注意事项
①菌落PCR时,加入菌液模板的体积不能过大,否则会影响PCR体系,导致扩增失败,般取1~2l做25l的PCR体系,模板如果太多了,引物就不够用了,显然扩增不出来,这种现象在以质粒为模板的PCR里面很多,提出来的质粒不要忘记稀释
②减少扩增循环,25-30个循环对于菌落PCR是比较合适,扩增循环过多,会产生假
③假阳性的控制。如果用载休引物来扩增一般可以降低假阳性,或者多用几对不同的引物扩增,以增加真阳性的筛选结果,PCR结果最好做酶切鉴定
④PCR条件的控制。热启动可以消除引物二聚体,退火温度可以低
六、应用
1.挑取重组子克隆
常规的碱裂解和煮沸法( Sambrook,1989)12均需要经过菌体过夜培养、菌体裂解及乙醇沉淀过程。一般情况下,在挑取的若干克隆中只有少部分为重组子,因此提取质粒过程消耗的时间很多,而利用菌落PCR挑取重组子克隆的过程则避开了提取质粒的繁琐过程。陈淑霞等人口利用单菌落PCR法直接筛选含有绿色荧光蛋自基因( green fluorescent protein,GFP)和不耐热肠毒素B亚基和耐热肠毒素融合基因( LTB-ST)外源基因的重组克隆,阳性克隆可以扩增出目的条带,和质粒PCR扩增进行比较结果一致。证明单菌落PCR进行重组菌阳性克隆的鉴定是非常有效的
2.基因组测序
传统的测序首PCR扩增是以碱裂解等方法抽提的DNA为模板,成功率高但较为繁琐,采用菌落PCR方法,将样品跳过DNA抽提这一步,直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增和荧光标记,使建库到测序前各步骤的总成本减少了1/3,唐晔盛等釆用该法成功测定了籼稻( Oryza sativa indica)广陆矮4号的L173号 BAC DNA全长序列
七、小结
常规PCR技术是目前分子生物学中的一种常用的鉴定方法和技术手段,在严格操作的前提下,PCR的结果是十分可靠的,但常规PCR扩增需要一些前期准备工作,如DNA模板的制备与纯化,操作繁琐,耗时费力,成本较高,而且DNA制备过程中的某些试剂会对扩增带来不良影响。因此,菌落PCR为简便快速地筛选DNA阳性重组克隆以及大规模基因测序等提供了一个简便、高效的途径.
