RNAi的作用机制及siRNA的合成方法（二）
2.3 倍增阶段
siRNA在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA为模板，siRNA为引物，扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶，产生更多的siRNA， 可再次形成RISC，并继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。并作用于靶mRNA。如此反复倍增，从而使RNAi的作用进一步放大。因此少量的siRNA就可以产生高效的基因沉默效果[10]。
3 RNAi的设计及合成
3.1 siRNA的设计
设计高效率的siRNA首先要通过NCBI、DDBJ、BMBL这3个基因序列数据库，检索相关的基因序列，获得靶向mRNA或cDNA序列，再就是合理设计siRNA。常规siRNA的设计原则是以成熟的mRNA为标准，若以DNA序列为参照，则最好选择cDNA转录区+50到+100以后的下游序列，两端的非翻译区不作为siRNA设计依据。siRNA二聚体的正义链和反义链各含21nt为佳，3'端为突出末端。3'凸端为尿苷(U)，5'凹端为腺苷(A)的mRNA序列应作为首选。进行Gen-Bank BLAST查询，确保所选siRNA编码不与其它基因同源[11]。不是mRNA的所有亚单位都能形成有效的siRNA，大约有60%~70%可以发挥沉默效应， 这是由于5‘和3’-UTR有丰富的调控蛋白结合区域，产生UTR结合蛋白或翻译起始复合物均可能影响RISC结合mRNA，从而影响siRNA的效果，所以沉默效应率差异较大，针对一个靶基因需要设计3~4条siRNA，以保证能够筛选出一条有效序列[12]。
3.2 siRNA的合成方法
制备siRNA的方法主要有化学合成法、体外转录法、酶消化法、体内转录法等。当已经找到最有效的siRNA时，适合以核苷酸单体为原料，通过化学方法合成两条互补的长约21~23 nt的RNA单链，然后退火形成双链复合体，这种方法所获得的产物纯度、干扰效率高，合成简单，但是制备周期长，作用时间短，而且价格昂贵限制了其应用和推广[13]。体外转录法[14]是以两段互补的DNA为模板， 在针对靶序列的正义链和反义链上游接上T7启动子，使用T7 RNA聚合酶，各自在体外转录获得两条单链RNA，将两条单链退火后形成双链RNA，然后用RNA酶消化，所得产物经纯化后就是所需的双链RNA，此方法适用于筛选有效的siRNA，但不适用于对特定siRNA进行长期研究。酶消化法[15]是先在体外化学合成200~1000 bp完整的目的基因长片段dsRNA， 用细胞内形成的siRNA关键酶-Dicer酶或者RNaseⅢ进行消化，即可得到各种不同的针对同一目的基因的不同位点的siRNA混合物，然后将混合物转染至细胞内，能得到较高的抑制效率。该方法抑制率高，且省时省力， 但此法产生的混合物可能导致非特异性抑制，另外在体外转录长链RNA有困难，Dicer酶费用较高[16]，此方法不适用于长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗。体内转录[17]是将siRNA的质粒、病毒表达载体或带有siRNA表达盒的PCR产物转入细胞，由细胞表达产生RNA干扰作用。siRNA表达载体常用能在哺乳动物细胞中表达shRNA的含有RNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)启动子的载体[18] ，通过转染含有RNA聚合酶II/III的启动子U6或H1，及其下游一小段特殊结构的质粒或病毒载体到宿主细胞内，转录出shRNA，该RNA在细胞内被Dicer酶剪切成siRNA而发挥作用。该方法的优点是细胞特异性强，适用于基因功能的长时间研究[2]。siRNA表达框(siRNA expression cassettes， SECs)[17]是一种由PCR制备的siRNA表达模板，可直接转入细胞进行表达而无需事先克隆到载体中。利用引物延伸法进行PCR，产生包含1个RNA聚合酶III启动子U6或H1、一小段编码shRNA的DNA模板和1个RNA聚合酶III终止位点的表达框架，然后直接转染到细胞内。该方法为筛选有效的siRNA片段和合适的启动子提供了较为便捷的工具[2]。其主要缺点是PCR产物转染细胞的难度大，如有转染试剂能提高SECs的转染效率，这一方法将得到更为广泛的应用。
参考文献
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