武大雷组 缺氧诱导因子HIF-2的激动剂，靶向贫血
缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors, HIFs）是人体内一类重要的转录因子， 可通过调节与红细胞生成、血管新生以及无氧代谢相关基因的转录，协助机体应对缺氧造成的压力【1】。因此HIF通路的活性异常，与癌症和贫血等多种疾病紧密相关。
具有转录活性的HIF蛋白复合体由HIF-α和ARNT（即HIF-1β）两个亚基组成，而HIF-α蛋白有三种亚型，其中HIF-2α的过表达和活化是导致肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）的主要原因。目前直接作用于HIF-2α的小分子拮抗剂PT2385（及其类似物PT2977）已经进入治疗ccRCC的二期临床试验，通过阻断HIF-2α与二聚伙伴ARNT的结合发挥抑制作用【2】，但其具体的分子机理尚不清晰。
另一方面，脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase domain, PHD）的多个小分子抑制剂，在治疗肾性贫血的三期临床试验中展现出良好效果【3】。特别是珐博进公司（FibroGen）的罗沙司他（roxadustat），作为I类新药2018年底刚刚被CFDA批准在中国首发上市。HIF-2α蛋白降解依赖于PHD对它的羟基化，因此这些抑制剂可以间接提高HIF-2α的蛋白水平和转录活性，增强下游基因促红细胞生成素（eythropoietin，EPO）的表达。但HIF-2α是否可被化合物直接激活、作为治疗贫血和缺血性疾病的潜在新靶标还未见报道。
2019年2月25日，山东大学微生物技术国家重点实验室武大雷课题组和牛津大学Fraydoon Rastinejad课题组在Nature Chemical Biology上在线发表了题为Bidirectional Modulation of HIF-2 Activity through Chemical Ligands的研究论文。该研究通过体外化合物筛选首次发现了直接结合HIF-2α蛋白的小分子激动剂，并利用蛋白-化合物共晶、氢氘交换质谱等手段，揭示了拮抗剂和激动剂如何通过HIF-2α-ARNT二聚界面处不同氨基酸残基的变构效应、影响二聚体稳定性并双向调节其转录活性的分子机理，为靶向HIF-2α蛋白设计新的抗癌（拮抗剂）和抗贫血（激动剂）药物提供了重要依据。
研究发现，拮抗剂PT2385结合在HIF-2α蛋白的PAS-B结构域中，使原本朝向结合口袋内部的M252残基侧链向二聚界面处外翻，从而降低了HIF-2α-ARNT二聚体的稳定性（图1a）。然后利用定点突变等手段，在生化和细胞水平都确证了M252是介导PT2385等拮抗剂发挥作用的关键残基。而且通过比较HIF-2α-ARNT二聚体与多种拮抗剂的共晶结构（包括PT2385、之前报道的拮抗剂0X3以及本研究中发现的新骨架拮抗剂T1001等），发现拮抗剂的活性与其对M252残基侧链的外翻程度呈正相关（图1b）。这些结果揭示了拮抗剂以变构效应抑制HIF-2转录活性的具体机理，并为改造和设计新的HIF-2α拮抗剂提供了重要参考。
图1：HIF-2α拮抗剂的变构机理。a， PT2385结合HIF-2α所引起的二聚界面处关键残基的构象变化；b，拮抗剂的抑制活性与其对M252残基侧链的变构程度相关。
研究还发现了可直接作用于HIF-2α蛋白的小分子激动剂。有意思的是，跟拮抗剂相似，这类激动剂也结合在PAS-B结构域中，但却导致二聚界面处不同氨基酸残基的构象变化。共晶结构显示激动剂使HIF-2α Y281残基的侧链外翻，从而与临近的ARNT Y456 残基形成额外氢键，使二聚界面更加稳定（图2a）。随后的氢氘交换质谱实验证明了激动剂对HIF-2α-ARNT二聚体的稳定作用，而点突变实验也验证了Y281对激动剂的变构效应非常关键。HIF-2α激动剂的发现及其作用机理的阐明，为HIF-2通路的功能研究提供了新的小分子工具，也为发现和设计活性更高的激动剂提供了关键信息。此外，研究发现在Hep3B细胞中，HIF-2α激动剂可与PHD抑制剂协同提高EPO基因表达（图2b），提示这两种提高HIF-2通路活性的策略或可联合采用，为肾性贫血及其他缺血性疾病的治疗提供了新的思路。
图2：a，激动剂M1001增强HIF-2α-ARNT二聚体稳定性的变构机理；b，激动剂M1002与PHD抑制剂molidustat或roxadustat（罗沙司他）的协同效应。
总之，此项研究所揭示的小分子通过变构效应影响二聚体稳定性、从而双向调节HIF-2通路活性的作用机理（图3），为设计更好的HIF-2α拮抗剂和激动剂指明了方向，也初步证明HIF-2α可作为治疗癌症和贫血性疾病的潜在双面靶标。此外，探寻调控转录活性的内源性配体一直是HIF研究领域的热点问题之一。本研究发现的激动剂，为潜在内源配体特别是某些代谢中间产物，参与精确调控HIF通路提供了一种可能的作用方式，也将有助于HIF-α蛋白内源性配体的发现。
图3：拮抗剂和激动剂结合在HIF-2α蛋白的同一口袋中，通过改变二聚界面处不同氨基酸残基侧链的构象，影响HIF-2α-ARNT二聚体稳定性和转录活性。
据悉，本论文以山东大学微生物技术国家重点实验室的武大雷教授为第一作者，武大雷和英国牛津大学的Fraydoon Rastinejad教授为共同通讯作者。山大的博士研究生刁晓彤也是该项研究的参与者之一。
武大雷教授是山大 “齐鲁青年学者”，博士生导师。2003年在山大生命科学学院获得学士学位，2008年在中科院上海药物研究所获得博士学位。毕业后在美国加州大学戴维斯分校和桑福德伯纳姆医学研究所从事博士后研究，2016年9月回到山大工作。主要研究领域为转录因子靶点蛋白的结构和功能及其药物发现，包括bHLH-PAS蛋白家族和核受体家族等。在Nature、Elife、Nature Communications等期刊上发表过多篇研究论文【4-6】，谷歌学术H-index值为19。目前课题组正在招聘博士后，欢迎对结构与分子药理学领域感兴趣的有志之士和武大雷教授联系（e-mail: dlwu@sdu.edu.cn）。
