固相化 pH 梯度双向凝胶电泳实验6
方案6 垂直 SDS 平板凝胶的制备：均一凝胶的灌制实验
| 实验方法原理 | 蛋白质通过 IEF 进行分离之后，可进行第二向电泳，即 SDS-PAGE。本方案详细介绍了灌制均一 SDS-PAGE 凝胶的方法。均一凝胶（具完全相同的%T和％c) 对特殊分子量范围的蛋白质有较好的分离效果，因其灌制方法简单而被普遍使用。 第二向凝胶可按三种不同方式（如尺寸）方便地制备：小胶用于 7 cmIEF 第一向凝胶；标准胶用于 11 cm、13 cm 以及 18 cm IEF 第一向凝胶；大型胶用于 18~24 cm 的 IEF 第一向凝胶。这些凝胶所用的试剂见下述，但在设备上要求不同。 如果凝胶用银氨方法染色，凝胶中的硫代硫酸钠可减少染色的背景水平（方案 11)(HochstrasserandMerril，1998, 见表 4.5 的注释）。 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1.安装玻璃板之前，用乙醇浸过的无棉纸巾擦拭玻璃板，以确保无灰尘颗粒粘在玻璃板表面。
2.对齐两块玻璃板，在两边放入 1.0mm 或 1.5 mm 隔片。 3.用恰好足够的压力将两块玻璃板及隔片夹住，使其保持在适当的位置。将其底部立于水平面上，保证两块玻璃板底边及隔片相互齐平，锁紧夹子。 玻璃板的底边和隔片相互齐平是很重要的，这能降低灌制胶时泄漏的可能性。 4.将装配好的夹子装人灌胶架，转动旋钮以使胶框（即夹在一起的玻璃板和隔片）卡紧于支架的塑胶条上。 5.用打字机或铅笔标记一小条滤纸作为凝胶的标签。将滤纸放在凝胶框的左边底部，不要用标记笔，因其会溶出渗入凝胶。 6.用不脱色记号笔在玻璃平板外面离上沿约0.5 cm 处作标记。 7.在灌胶之前将水加人凝胶框来确定凝胶溶液的体积。在灌胶前从凝胶框中除去全部的水，否则凝胶中丙烯酰胺的浓度会受影响。在真空瓶中配制准确体积的凝胶溶液（由表 4.5 计算），TEMED 和过硫酸铵的体积忽略不计。 8.在溶液中加一个小磁力搅拌子，用水抽真空泵抽几分钟以除去溶液中的空气，在磁力搅拌器上搅拌溶液。 虽然并非所有研究者都进行抽空气这步，但为了更佳的重复性，建议进行此步操作。 9.在瓶中加 TEMED 和过硫酸铵，轻轻搅拌至混合，不要产生气泡。 10.用吸头缓慢加入凝胶 (从一个角落滴加），加至距上沿 0.5 cm。 11.立即在凝胶上方加一薄层（100~500ul) 水饱和的正丁醇以避免凝胶暴露在氧气中，并且可使凝胶表面平整。
12.让胶聚合至少 lh。 13.在聚合之后，检查每块胶是否完全聚合并且均一，同时检测胶的上表面是否水平。用双蒸水或去离子水清洗胶表面。 14.此胶可用于第二向电泳（方案 9)，并可在 4°C 储存两周。 储存的胶应用胶储液覆盖，并且用塑料膜紧密缠绕好。 展开 |
