利用PCR分析酵母菌落
利用PCR分析酵母菌落
实验方法原理 |
用 PCR 分析酵母菌落时,无需纯化 DNA。本方案以单个酵母菌落的粗裂解液作为 PCR 扩增的模板,来确定酵母中是否携带目的 DNA 序列。 |
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实验材料 | Taq DNA 聚合酶 寡核苷酸引物 DNA 标准参照物 YAC 重组子的酵母菌株 |
试剂、试剂盒 | PCR 缓冲液 dNTP 溶液 |
仪器、耗材 | 琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶 微量离心管 程控式 PCR 仪 |
实验步骤 |
一、材料 展开 |
注意事项 |
1. 设计引物很关键。一般如果是定向克隆,用载体上的通用引物即可。如果是非定向克隆(如单酶切或平末端连接),一条引物用载体,一条引物用目的基因上的,这样就可以比较方便的鉴定了,而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳,同时挑取的菌体不宜太多,否则会有非特异性扩增。 2. 使用的引物浓度不能太高,浓度过高会导致非特异性扩增,反应的循环数也不能太多,一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题,有的GC含量很低,有的又很高,导致菌落PCR不容易扩增出目的条带,在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限,每一循环降0.2度左右。
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