NCB | 这一次，FTO是snRNA的m6Am去甲基化酶
RNA的m6A修饰是RNA表观遗传学研究领域的大热门，近年来相关研究多次登上高分杂志。从胚胎发育到疾病进程，从RNA的稳定性到可变剪接和翻译效率，m6A的功能几乎无处不在（图1）。
图1
由于m6A是一种RNA修饰，若想知道它在某一体系（发育阶段或癌症）中的作用，目前大部分研究都是基于影响m6A甲基化酶和去甲基化酶完成的。事实上，早在1974年，两个研究组几乎同时发现m6A在mRNA上富集【1，2】。而直到近十年，由于基于m6A的RNA测序MeRIP-Seq的开发【3】和m6A甲基化酶和去甲基化酶的鉴定，大家才意识到m6A是可逆的修饰，并且有方法去操纵它，也逐渐投入相关研究。
然而，随着研究的深入，争议也越来越多，甚至关于FTO是否是m6A去甲基化酶，目前尚无统一的定论（最近北大贾桂芳团队和上海交大张良团队合作解决了上述争议，详见BioArt今日发布的另外一条报道：PNAS丨贾桂芳/张良合作组揭示m6A去甲基酶FTO对底物的作用机制）。
FTO，也称为ALKBH9，属于α-KG依赖的加双氧酶ALKB家族蛋白。FTO最初受到关注，是在GWAS研究中，发现它与肥胖相关【4，5】，然而它的具体功能，作用底物等，一直是未知的。2011年12月，何川教授研究组在Nature Chemical Biology发表研究N6-Methyladenosine in nuclear rna is a majorsubstrate of the obesity-associated FTO，发现FTO主要定位在细胞核中，是RNA的m6A修饰的去甲基化酶【6】。
基于该研究，2016年12月，何川与陈建军教授在Cancer Cell发表研究 FTO Plays an Oncogenic Role in Acute Myeloid Leukemia as a N6-Methyladenosine RNA Demethylase，发现FTO通过影响ASB2和RARA等基因的m6A修饰，在急性髓系白血病中发挥癌基因的作用【7】。也由此打开了FTO作为mRNA的m6A去甲基化酶参与癌症进程的研究。
然而，仅过去一个月，2017年1月，康奈尔大学的Samie R. Jaffrey研究组在Nature发表研究Reversible methylation of m6Am in the 5′ cap controls mRNA stability，颠覆FTO作为m6A去甲基化酶的作用，认为FTO的真正作用底物是m6Am【8】（详见BioArt的相关报道与回应：真的搞错了吗？RNA去甲基化酶FTO的作用底物解读丨特别推荐）。
M6A与m6Am确实长得像，但它们的功能是不同的（图2）。一时间，FTO的身份变得扑朔迷离。
图2
何川与陈建军教授的行动也很快，同年12月14日，再次联手在Cell发表研究R-2HG Exhibits Anti-tumor Activity by Targeting FTO/m6A/MYC/CEBPA Signaling，详细地分析了FTO对m6A和m6Am的作用，发现FTO确实也是m6Am的去甲基化酶，然而m6A的丰度远高于m6Am，并且在FTO敲除细胞系中，m6A的变化更明显【9】。因此，该研究认为FTO在白血病中通过影响m6A，而不是m6Am发挥癌基因的作用。
那么，在其他体系中，FTO是否会倾向作为m6Am的去甲基化酶？FTO的底物除了mRNA，是否还有其他类型的RNA？FTO的作用底物只能是m6A吗？
何川与陈建军教授本着对科研的不懈探索，对以上问题进行了研究。2018年9月，他们在Molecular Cell发表研究Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm，该研究系统的研究了FTO的功能（详见BioArt此前的报道：不能把“功劳”都算到m6A头上，FTO不仅仅是m6A去甲基化酶），首次发现FTO不仅定位于细胞核中，在某些情况下，也存在细胞质中，并且FTO的定位与功能密切相关【10】。细胞核中的FTO作为poly A RNA的m6A，snRNA的m6A和m6Am以及tRNA的m1A去甲基化酶，而细胞质中的FTO主要作为poly A RNA的m6A和m6Am，以及tRNA的m1A去甲基化酶（图3）。
图3
这看上去是“面面俱到”的结果，这场纷争似乎也将告一段落。然而，康奈尔大学的Samie R. Jaffrey教授也在一直关注FTO，时隔不到半年的时间，近日，他们在Nature Chemical Biology发表研究FTO controls reversible m6Am RNA methylation during snRNA biogenesis，再次颠覆之前的观点，发现FTO最主要的作用底物是snRNA的m6Am修饰，并以此影响mRNA的可变剪接（图4）。
图4
在FTO敲除的细胞中，mRNA上的m6A仅上升了10%左右，这提示其他类型的RNA上的修饰有可能才是FTO最主要的作用底物。
研究者利用miCLIP的方法，全局的分析敲低FTO后，转录组中6mA（包括m6A和m6Am）上升的RNA。由于该方法没有富集polyA的RNA，因此可以鉴定整个转录组中各类RNA上6mA的变化。研究发现Sm-snRNA的6mA变化最为显著（图5），进一步分析显示Sm-snRNA中的U1，U2，U4和U5的6mA变化最明显，而属于Lsm-snRNA的U6，则不响应FTO的变化（图5）。
图5
那么，Sm-snRNA上的6mA变化，属于m6A还是m6Am呢？TLC（thin-layer chromatography）结果显示，敲低FTO后，m6Am的上升最为明显，说明FTO介导了snRNA上m6Am的去甲基化（图6）。
图6
SnRNA是真核生物中丰度最高以及研究得最多的一类非编码RNA。由于它们是尿嘧啶（U）富集的小RNA，因此命名为U1，U2等。SnRNA主要参与最基础和重要的生物学过程：pre-mRNA的可变剪接。根据结合蛋白的不同，snRNA可分为Sm-snRNA和Lsm-RNA。其中，Sm-snRNA由RNA聚合酶II转录，像mRNA一样拥有m7G的帽子结构。新生的snRNA被运送到细胞质中做进一步的加工，包括剪接和添加各类修饰。M7G帽子再次被甲基化，变成TMG（N2,2,7-trimethylguanosine）帽子。此时，snRNA与相应的Sm蛋白结合在细胞质中结合，再次被运送到细胞核中发挥功能。没有被正确加工的snRNA无法与Sm蛋白结合，会在细胞质中被降解。
因此，普遍的观点认为snRNA是“单一”形式的，同一种snRNA拥有的修饰相同，未被正确修饰的snRNA都会被降解。而该研究发现snRNA上存在可逆的m6Am修饰，将snRNA分为两类：m1 isoform（2′-O-methyladenosine, Am）和m2 isoform (N6,2′-O-dimethyladenosine, m6Am)，这对snRNA的认识是一个突破。
同时，研究者发现m1 isoform 和m2 isoform snRNA对可变剪接的影响不同，后者倾向于外显子的保留。事实上，有研究发现FTO影响可变剪接【11】，但是另一项研究则认为新生pre-mRNA上的m6A修饰对可变剪接的影响非常有限【12】。该研究从snRNA的角度，对FTO影响可变剪接给出了另一种解释。
总的来说，该研究首次将FTO的主要作用底物定性为snRNA，并发现snRNA m6Am修饰影响可变剪接。这是snRNA领域的一大进展。然而，我们也该注意到，虽然不如snRNA上的m6Am变化明显，但是FTO也可以影响mRNA上的m6A修饰，这种影响，是FTO活性的“副产物”，还是一种“微调”却有大作用的生理现象？另外，FTO在白血病中发挥癌基因的作用是否与snRNA相关呢？m6Am是如何影响snRNA对外显子的选择？这一系列问题，都还需进一步研究。
参考文献
1. Desrosiers R, Friderici K, Rottman F. 1974. Identification of methylated nucleosides in messenger RNA from Novikoff hepatoma cells. PNAS 71:3971–75
2. Perry RP, Kelley DE. 1974. Existence of methylated messenger RNA in mouse L cells. Cell 1:37–42
3. Dominissini D, Moshitch-Moshkovitz S, Schwartz S, Salmon-Divon M, Ungar L, et al. 2012. Topology ofthe human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature 485:201–6
4. Scott LJ, Mohlke KL, Bonnycastle LL, Willer CJ, Li Y, Duren WL, et al.2007. A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants. Science. Jun 1；316(5829):1341-5.
5. Frayling TM1, Timpson NJ, Weedon MN, Zeggini E, Freathy RM et al.2007. A common variant in the FTO gene is associated with body mass index and predisposes to childhood and adult obesity. Science. May 11；316(5826):889-94.
6. Jia, G., Fu, Y., Zhao, X., Dai, Q., Zheng, G., Yang, Y., Yi, C., Lindahl, T., Pan, T., Yang, Y.-G., and He, C. (2011). N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat. Chem. Biol. 7, 885–887
7. Li, Z., Weng, H., Su, R., Weng, X., Zuo, Z., Li, C., Huang, H., Nachtergaele, S., Dong, L., Hu, C., et al. (2017). FTO Plays an Oncogenic Role in Acute Myeloid Leukemia as a N6-Methyladenosine RNA Demethylase. Cancer Cell 31,127–141
8. Mauer, J., Luo, X., Blanjoie, A., Jiao, X., Grozhik, A.V., Patil, D.P., Linder, B., Pickering, B.F., Vasseur, J.J., Chen, Q., et al. (2017). Reversible methylation of m6Am in the 50 cap controls mRNA stability. Nature 541, 371–375
9. Su, R., Dong, L., Li, C., Nachtergaele, S., Wunderlich, M., Qing, Y., Deng, X., Wang, Y., Weng, X., Hu, C., et al. (2018). R-2HG Exhibits Anti-tumor Activity by Targeting FTO/m(6)A/MYC/CEBPA Signaling. Cell 172, 90–105.e23
10. Wei, J. et al. Diferential m6A, m6Am, and m1A demethylation mediated by FTO in the cell nucleus and cytoplasm. Mol. Cell 71, 973–985.e5 (2018).
11. Zhao, X. et al. FTO-dependent demethylation of N6-methyladenosineregulates mRNA splicing and is required for adipogenesis. Cell Res. 24,1403–1419 (2014).
12. Ke, S. et al. m6A mRNA modifcations are deposited in nascent pre-mRNAand are not required for splicing but do specify cytoplasmic turnover. GenesDev. 31, 990–1006 (2017).
