实时荧光定量 PCR 原理
实时荧光定量 PCR 技术,是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。
实时定量 PCR 技术是在常规 PCR 基础上,添加了一条标记了两个荧光基团的探针。
一个标记在探针的5'端,称为荧光报告基团(R);
另一个标记在探针的3'端,称为荧光抑制基团(Q)两者可构成能量传递结构,即5'端荧光基团所发出的荧光可被荧光抑制基团吸收或抑制。
当二者距离较远时,抑制作用消失,报告基团荧光信号增强。荧光信号随着 PCR 产物的增加而增强。
实时定量 PCR 方法就是利用此原理,在 PCR 过程中,连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一阈值(PCR 反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍)时,此时的循环次数(Ct 值)就被记录下来。
该循环参数(Ct 值)和 PCR 体系中起始 DNA 量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度标准品的 Ct 值,制成标准曲线,再根据样品的 Ct值就可以准确确定起始 DNA 的数量。
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