实时荧光定量PCR原理、特点和应用领域（三）
1、Ct值的定义
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
2、荧光域值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle6-15
3、Ct值与起始模板的关系
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
4、荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
实时荧光定量PCR技术的应用领域
实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对PCR产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：
DNA或RNA的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。
基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA或差显结果的确证。
基因分型。例如SNP检测，甲基化检测等。
实时荧光定量PCR技术在医疗方面的应用：
病原体检测：
目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、肝炎病毒、结核杆菌、细小病毒B19、EB病毒和人巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
遗传及优生优育诊断：
到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。例外还可以通过实时荧光定量PCR对孕妇弓形虫，梅毒等检测，这对找出不明原因流产和习惯性流产的病因提供有力的帮助，大大提高优生优育。
指导治疗：
对病原体定量分析显示：病原体量与某些药物的疗效关系。如HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异等。
肿瘤基因检测：
尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。p53癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现，荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。
免疫方面检测：
通过荧光定量PCR检测出B27，HLA等来帮助诊断免疫性疾病，如强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、器官移植排异反应等。
实时荧光定量PCR技术在药物研究方面的应用：
新药开发研究，
人用药物及其他药物：针对一些感染性疾病的药物，如各种病毒病、细菌病等，在新药的开发过程中，快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金，与以前所用的Elisa等方法相比，实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量，因此有利用分析药物的作用效果，为比较不同的配方的疗效、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。
超早期感染用药物及疗法的研究与开发：
实时荧光定量PCR方法测定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到病人体内产生抗体，同时，由于其灵敏度与Elisa相比不可同日而语，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低时就可以测定。因此就出现了一个新的领域，即在病毒或细菌含量很低时如何用药，用什么药以及用药量等进行研究，为将疾病消灭在超早期作出贡献。
药物疗效研究：
对于一些已经上市的新药或是应用了很长时间的老药，其用药的效果以及用药量及用药时间都可以进行进一步的研究，为更加合理化的应用这些药物为人类造福进行进一步的研究。以前所用的方法由于不能准确定量，灵敏度也不够，因此有很多需要研究的内容没有完成。这一方面需要研究内容很多，意义也很大。
新的愈后指标的研究：
对于感染性疾病，在药物作用至一定程度后，就认为可以停药了，但是应该在什么停药，现在大都没有一个明确的指标，现在所用的指标由于受到检测方法的灵敏度及准确性限制，这一指标未必合理，因此有必要对治愈的指标以及指标与复发率以及疾病转化为其他疾病之间的关系等进行进一步的研究，从而为药物或疗法彻底治愈疾病打下坚实的理论基础。
新诊断及检验试剂的开发：
现有的很多诊断及检验方法都不能同时满足快速、灵敏、定量的要求如现有培养法、Elisa法等等，而荧光定量PCR方法以则可以做到这一点，从而可为临床疾病、商检、粮油检验、食品检验、血液检验等等开发新的试剂，从而提高检验的灵敏度、速度及准确性等；这类试剂的种类是非常多的，所开发的试剂的社会效益及经济效益都是很巨大的。
实时荧光定量PCR技术在检测人感染A（H1N1）型猪流感病毒上的应用：
2009年4月，全球性的人感染猪流感公共卫生事件发展势头迅猛，发生国家众多，世界卫生组织29日晚已将全球流感大流行警告级别从4级提高到5级，我国也于28日召开了国务院常务会议对防控进行了部署。现在已进入关键的防控措施落实阶段，其中检测与诊断技术至关重要。
人感染猪流感疫情发生后，美国疾病预防控制中心（CDC）于2009年4月28日发布了针对人感染猪流感病毒治疗和预防临时指南，其中规定了确诊病例的诊断方法：具有急性发烧呼吸道疾病的临床症状并且经实时荧光定量PCR(real-timeRT-PCR)或病毒分离培养(viralculture)实验室检测方法检验证实感染A（H1N1）型猪流感病毒。
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