NADP 磷酸酶（NADPase）试剂盒说明书
NADP 磷酸酶（NADPase）试剂盒说明书 分光光度法 50 管/48 样
注 意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： NADPase 主要存在于植物组织中，是生物体内唯一催化 NADP+降解为 NAD+的酶，与 NADK 一起调控 NAD 和 NADP 之间的平衡。 测定原理： NADPase 能够催化 NADP+水解为 NAD+和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定 NADPase 活性。 所需的仪器和用品： 可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水 试剂的组成和配制： 提取液：60mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 30 mL×1 瓶， 4℃保存。 试剂二：粉剂×5 支，-20℃保存；用时每支加入 1 mL 试剂一充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保 存，禁止反复冻融。 试剂三：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃可保存一周。 试剂四：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃可保存一周。 试剂五：液体 25mL×1 瓶，室温保存。 试剂六：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。 0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂六 20 倍稀释，即取 0.5mL 试剂六加 9.5 蒸馏水，充分混匀。 定磷试剂的配制：按 H2O: 试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂 应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。 注 意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。 样本的前处理： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进 行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 操作步骤： 1、酶促反应 试剂名称（μL） 测定管 对照管 试剂一 300 300 试剂二 100 100 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热 5min 样本 100 蒸馏水 100 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确反应 30min 后，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失），冷 却后，10000g 25℃离心 5min，取上清 QQ 1019057849 2、定磷 标准管 空白管 测定管 对照管 0.5μmol/ml 标准磷应用液 100 蒸馏水 100 上清液 100 100 定磷试剂 1000 1000 1000 1000 混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 30min，冷却至室温，在 660nm 处，蒸馏水调零，记录 各管吸光值。 注意事项： 1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或 磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，最后用蒸馏水冲干净。最 好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。 2、标准管、空白管和对照管只要做一次即可。 NADPase 酶活性计算： 1、按组织蛋白浓度计算： 定义：每小时每毫克组织蛋白 NADPase 分解 NADP 产生 1μmol 无机磷的量为一个 NADPase 活力单位。 NADPase (μmol/h/mg prot)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷ (V 样×Cpr)÷T=5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 定义：每小时每 g 组织 NADPase 分解 NADP 产生 1μmol 无机磷的量为一个 NADPase 活力单位。 NADPase (μmol/h/g 鲜重)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管）× V 总÷(W× V 样÷V 样总)÷T=5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.5mL；V 样：加入样本体积，0.1mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重， g。
