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酶活性测定条件的选择和限定-2

2019.4.24

　曲线A：V对pH作图曲线B：酶先在pH5及pH8预孵育后，在pH6.8测活性

　　氢离子可以通过多种途径影响酶催化反应。如在脱氢酶反应中往往需要氢离子参加，也可能产生氢离子，从理论上可以将氢离子看成是该反应的底物和产物之一。此外，当pH变化时，可影响到底物、酶、酶-底物复合物的解离状态和构型，甚至还可能影响到各种辅因子，从而影响酶活性。

　　PH对酶还有一个重要的作用，就是影响酶的稳定性。图17-3B介绍一个有关实验。

　　图中曲线A是最适pH实验的结果，出现典型的钟形曲线，其最适pH为6.8，高于或低于6.8时，酶反应速度下降，下降原因可能与上述诸因素有关，但也可能由于酶稳定性下降失活所致，或者是二类原因之总和。通过曲线B的实验，可将上述二类原因分清。此时先将酶与不同pH底物缓冲液温育一段时间，此时间一般与测定时间相当，然后再将pH调回最适pH处测其活性。从曲线B可以说在pH5-6.8以及pH6.8-8.0之间酶活性的下降与酶灭活关系不大，酶在最适pH处储存常数稳定。但有些酶贮存在最适pH时，并不一定比在其它pH处更稳定。

　　最适pH并非是酶的特征性常数，易受多种因素影响而改变，如缓冲液的种类、底物浓度、温度等，在研究pH对酶稳定性影响还应注意到酶浓度高低，在低浓度时，酶易解离为单体，常比多聚体更易灭活。还应注意试剂中各种防腐剂和其它添加剂的影响。

　　最后必须强调的是本节讨论的pH并不是指底物缓冲液的pH，而是底物和标本混合后的pH对反应速度的影响，由于实验室所测的标本很少是纯酶样品，多为体液或组织粗提液。它们也是有一定pH值和缓冲能力的缓冲液，和底物缓冲液混后后，不一定维持住原来pH，特别是当二溶液的pH相差甚远时，变化更大。例如碱性磷酸酶最适pH为10.2，虽然底物pH也是10.2，但血清标本pH为中性，混合液的pH必然低于10.2，降低程度取决于血清的pH和缓冲能力。从而影响酶测定结果，临床观察证实：当血清标本放置过夜后用金氏法再测碱性磷酸酶时，结果常升高。有人认为这与血清放置过长，由于CO₂逸出引起血清pH偏碱有关。

　　在下列情况极易引起混合液pH偏离底物缓冲液的pH：一是标本用量太大，如以前有些方法，为节省底物，底物缓冲液用量和血清用量相等，此时混合液pH可能在此二液pH之间，有可能引起较大测定误差。所以在文件中规定“标本在总体积中的比例应在10％以下”。就是要尽量减少标本中各种物质对测定结果的影响。二是底物缓冲液缓冲能力太低。如金氏法测碱性磷酸酶时使用的碳酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，浓度这样低的缓冲液，必定要受标本pH的影响。

　　过去长期以来，认为缓冲液作用就是维持酶反应的最适pH，忽视了缓冲物质对酶反应的其它作用和影响，Howell等研究了酶活性在三种不同缓冲液的变化情况见图17-4。

图17-4　各种缓冲液的温度及pH的关系
TRIS：三羟甲基氨基甲烷0.1mol/L
TRA：三乙醇胺0.1mol/L

　　三种不同缓冲液不仅最适pH不一样，最大反应速度也有差异，从测定酶活性浓度角度，应该选用枸橼酸缓冲液，类似现象在大多数酶都能观察到，仅是程度不同，其中以碱性磷酸酶活性受到缓冲液种类影响最为显著，在二乙醇胺缓冲液所测酶活性约比在碳酸盐缓冲液所测的高2倍。

　　由于缓冲液含有大量离子，或影响酶蛋白的构型，或影响底物的解离程度等等，从而影响酶活性。Allert曾拟定了一种作用模式，并进行数学计算，得出相应方程式来说明反应体系中电解质会影响最大反应速度V，且不同浓度电解质的影响有差异。因此在方法设计时，选完缓冲物质后，还必须了解不同浓度缓冲液对酶活性的影响。一般而言，随缓冲液浓度增加，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，所以选择缓冲液浓度时，常需在浓度较高以保持足够缓冲能力和浓度较低以免抑制酶活性两个相矛盾作用之间取得平衡。

　　在目前酶测定常用的一大类所谓生物缓冲物质，如图中的Tris、三乙醇胺受温度影响较大。因此在我国学会文件中指出“配制缓冲液时不仅要指出其pH值，还应说明配制温度，以避免因温度不同而引起的误差。”在此图中还可看到，即使是同一种缓冲液，随其它物质存在，也有可能改变温度的影响。因此在实际配制缓冲液时，应首先将配制溶液温度调节到规定温度，然后在pH计监测下加入相应的酸或碱将溶液pH调到要求范围。不控制温度，不用pH计盲目按一些书提供的量配制缓冲液是不可取的。

　　四、其它影响酶活性因素

　　除了上述主要因素外，一些其它因素也会影响酶活性，如反应体系中含有氧化剂，可氧化酶蛋白中甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸残基，使酶失活，试剂盒中常用的一些表面活性剂如Tween-80、Brig-35等会抑制一些酶的活性。

　　其它因素中，对酶测定而言，最重要的是抑制剂的作用，抑制作用是酶学中的一个重要研究内容。但如只涉及到设计和选择测定酶的方法，则比较简单，既然要测定的是“最适条件”下的最大反应速度，那么不论是可逆或不可逆抑制剂，也不论是竞争性、非竞争性、反竞争性抑制剂都应在反应体系中设法除去。此问题在测定尿液中尤为突出。尿中排出大量代谢产物，不少物质会影响酶，如脲可使酶解聚、磷酸盐抑制磷酸酶活性。在病理情况下尤其使用各种药物后，使情况更为复杂，此时尿中可出现不少正常情况下不出现物质，即可能抑制酶活性，也可能激活酶活性。为使脲酶测定结果有一定可比性，最好在测定脲酶前，通过透析、凝胶层析或超滤将小分子化合物与酶分开，这样较为可靠。

　　五、温度的控制

　　要了解此问题，应注意温度对酶活性影响的双重性。首先，化学速度随温度升高而加快，酶反应也不例外。Q₁₀值即温度增加10℃，化学速度的变化率。酶的Q₁₀值约在1.5-2.5之间。

　　温度与反应速度之间关系，可用Arrhenius方程式来表示：

　　Logk＝－E/2.303RT+常数

　　式中k是反应常数，T为绝对温度，R为气体常数。E为活化能也是常数。在酶反应中V＝K·[E]。所以在酶反应中，LogV和1/T作图为一直线，斜率为－E/2.303R。通过每一直线斜率不难计算出该酶反应的活化能E。

　　但是，测定酶时都需要酶和底物在一定温度下作用一段时间，在此期间，温度有可能使酶失活，不同酶在此方面差异很大，有些酶如胎盘碱性磷酸酶在56℃放置15分钟，活性也不下降，有些酶如酸性磷酸酶，37℃1小时后，失去50％酶活性。酶的稳定性还与其它因素，如作用时间、pH、有无底物、有无其它蛋白等有关。同为碱性磷酸酶，在肝提取液中远不如血清中稳定，37℃作用15分钟后肝中此酶活性将显著下降。又如将血清pH降低在pH6.0以下，血清中酸性磷酸酶将长期稳定。

图17-5　预温15分（37℃，pH9.9）对ALP活性的影响
○与●表示肝ALP活性不预温和预温的变化
△与▲表示血清ALP活性不预温和预温的变化

图17-5形象说明预温过程对酶活性的影响。

　　目前常规工作实验室越来越多的使用37℃，一些国家已明确推荐使用此温度。这更多地是从实际工作方便来考虑。因为温度升高，反应速度快，灵敏度高。同时延滞时间和测定时间都可能缩短。从而有利于提高工作效率。尤其目前在常规实验室中广泛使用全自动生化分析仪，有高效率的恒温系统，使反应系统很快升温并维持在37℃，可避免温度差异引起的误差。但在37℃时，不可避免地一些酶可能失活。

　　早期曾推荐使用25℃为酶测定温度，其优点为接近室温，反应体系温度很容易平衡到此温度，这对于当时使用无有效控温系统的分光光度计来测酶活化性有其特别方便之处。但温度低。反应太慢。在有些温热地区，当室温超过25℃时，还需使用降温系统很不方便。因此目前已很少有实验室采用此温度。

　　IFCC推荐的30℃，兼顾了上述二温度的优点，即保证了一定的反应速度。又无酶失活之扰，此外还有一个上述二温度没有的优点，即可以镓作为此温度的基准物质，纯镓的熔点为29.77℃。保证了测定系统计30℃的高度准确性，而37℃和25℃至今尚无一个最准确的确定方法。

　　30℃和37℃是目前使用最广泛的二种测定酶的使用的温度。在比较不同实验室测定结果时，一定要注意由此引起来的差异，否则将导致临床诊断的困难和误差。一些作者提出使用二温度间的转换系数使二温度测定结果的比较变为可比。虽然一些作者持怀疑态度，用一个系数能代表所有标本中的变化情况吗？最新研究证实只要所用方法合适，人类血清中酶对温度变化的反应差异不大，在无法统一温度情况下，这还不失为一权宜之计，常用酶的温度转换系数可参见表17-4：

表17-4　常见酶温度转化系数