醋酸纤维素薄膜电泳
6、定量
（1）浸泡
将膜片上的各蛋白质分离区带分段剪下，分别置于相应的标有编号的试管内，然后各加入0.4mol/L的氢氧化钠溶液进行浸泡。浸泡淡色带所加入的0.4mol/L氢氧化钠溶液的量为4ml，深色带为8ml（此时的稀释倍数是淡色带的2倍）。室温下的浸泡时间为
30min～60min。若在37℃水浴中浸泡，则为10min～15min。浸泡期间振荡数次，使蛋白质区带浸出。另外再剪取与色带膜条大小相同的无色带膜条作为空白，以相同的方式浸泡在0.4mol/L氢氧化钠溶液中。
（2）比色 浸泡完毕，将浸出的有色溶液在分光光度计上进行比色测定。测定波长为620nm，光径为1cm。若浸出液有混浊或沉淀，则以4000r/min的转速离心10min～20min除去，然后再取上清液进行比色测定。
（3）计算 比色测定结束后，各组分的含量按下式计算：
某蛋白质组分百分含量＝某蛋白质组分的光吸收值/样品中各蛋白质组分的光吸收值总和×100％
上式中深色带蛋白质组分的光吸收值应乘以稀释倍数2，例如血清白蛋白组分的分离区带为深色带，浸泡时所加入的0.4mol/L氢氧化钠的量是其它淡色带的2倍，所以应乘以2。
[方法评估]
1、醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有以下优点
（1）醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。
（2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。
（3）灵敏度高，样品用量少。 血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至0.1μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。
（4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。
（5）醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。
2、醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，操作简单，但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出5—6条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。
[应用意义]
由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价。目前已广泛用于检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病，肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而成为医学和临床检验的常规技术。
[注意事项]
1、醋酸纤维素薄膜的预处理
市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15s—30s时，膜片吸水不均匀，则有白斑点或条纹，这提示膜片厚薄不匀，应舍去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染，取膜时，应戴指套或用镊子。
2、缓冲液的选择
醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液，其浓度为0.05mol/L—0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为8
cm—
10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm膜宽。当电泳达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨。
3、加样量
加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品0.1μl—0.5μl约相当于5μg—1000μg蛋白。血清蛋白常规电泳分离时，每厘米加样线加样量不超过1μl，相当于60μg—80μg的蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。
点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。
4、电量的选择
电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm宽膜为宜。电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。
5、染色液的选择
对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素膜溶解。
应控制染色时间。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区分，或造成条带染色不均，必要时可进行复染。
6、透明及保存
透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。
透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中，使薄膜软化。如有水，则液体石蜡不易浸入，薄膜不易平展。
