血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
实验概要
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳技术
实验原理
带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。电泳技术被广泛用于蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定，电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的粘度等有关。其中粒子荷电量又受周围介质的pH和离子强度的影响；电场强度则取决于电泳时所加的电压。为了克服溶液对流现象对电泳离子的影响一般在电泳体系中加入不流动的固相支持物。根据支持物的种类及操作方式的不同，可将电泳分为许多种类，如滤纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳，淀粉颗粒或聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
本实验系以醋酸纤维素薄膜为固相支持物，用于分离血清蛋白质，由于清蛋白及几种球蛋白的有关特性不同（见下表），可被分为清蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白等部分。
正常人血清蛋白质的等电点，分子量及其在醋酸纤维素薄膜电泳上的测定结果。
| 血清蛋白质 | 等电点 | 分子量 | 占总蛋白的％ |
| 清蛋白 | 4.64 | 69.000 | 57~72 |
| α1－球蛋白 | 5.06 | 200.000 | 2~5 |
| α2－球蛋白 | 300.000 | 4~9 | |
| β－球蛋白 | 5.12 | 90.000~150.000 | 6.5~12 |
| γ－球蛋白 | 6.85~7.3 | 156.000~950.000 | 12~20 |
主要试剂
巴比妥缓冲液，pH8.6，离子强度0.06
巴比妥钠 12.76g
巴比妥 1.66g
用少量蒸馏水加热溶解后，再加水稀释至1000ml．
氨基黑10B染色液
氨基黑10B 0.5g
甲醇 50ml
冰醋酸 10ml
蒸馏水 40ml
漂洗液
95％乙醇 45ml
冰醋酸 5ml
蒸馏水 50ml
新鲜血清
0.4N氢氧化钠溶液
实验步骤
1．准备与点样：取两条2.5×8cm的膜条
（1）将簿膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透。
（2）将充分浸透的膜条取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以醋纤膜的无光泽面距一端1.5cm处作为点样线。
（3）用点样器在盛有血清的表面皿中蘸一下，点样器下端粘上薄层血清，然后将点样器竖直，使其沾有血清的顶端紧贴在薄膜点样线上，待血清全部渗入膜内后，移开点样器。
2．电泳
将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时膜条无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极，槽架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5分钟后，即可通电。调节电泳仪，使两极间距（指膜条与滤纸桥总长度）的电压为15V/cm，电流0.4~0.6mA/cm膜条，通电50分钟左右关闭电源。
3．染色
通电完毕后，用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5分钟，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。
4．定量
取试管6支作0~5编号，第一管加0.4N氢氧化钠6.0ml，其余各管各加0.4 N NaOH 3.0m1。将染色后的薄膜按各条蛋白色带剪开，清蛋白部分放入第一管中，其余各部分依次放入其余4管中，另外一管放入一小块电泳谱上γ－球蛋白后面的无蛋白区带的薄膜，其大小约与α1球蛋白区带相当，作为空白管。连续振摇数次，侍染料全部脱下后，充分混合。将溶液倾入小比色皿，用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白管作对照，读取各管的光密度（色泽在12小时内无变化的光密度）。
5. 计算
光密度总和 T＝2A＋α1＋α2＋β＋γ
（1）计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。
（2）计算出清蛋白与球蛋白之比值（A/G），G=α1＋α2＋β＋γ
