醋酸纤维素薄膜电泳法的操作过程和所需仪器
1.仪器装置
电泳室及直流电源同纸电泳。
2.试剂
(1) 巴比妥缓冲液(pH8.6)
取巴比妥 2.76g,巴比妥钠15.45g,加水溶解使成1000ml。
(2) 氨基黑染色液
取 0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
(3) 漂洗液
取乙醇 45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混匀。
(4) 透明液
取冰醋酸 25ml,加无水乙醇75ml,混匀。
3.操作方法
(1) 醋酸纤维素薄膜
取醋酸纤维素薄膜,裁成 2cm×8cm的膜条,将无光泽面向下,浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夹于滤纸中,轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。
2) 点样与电泳
于膜条上距负极端 2cm处,条状滴加蛋白含量约5%的供试品溶液2～3μl,在 10～12V/cm电位梯度下电泳。电泳区带距离以4～5cm为宜。
(3) 染色
电泳完毕,将膜条取下浸于氨基黑染色液中,2～3 分钟后,用漂洗液浸洗数次,直**脱去底色为止。
(4) 透明
将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中 10～15分钟,取出平铺于洁净的玻板上,干后即成透明薄膜,可于分光光度计上测定和作标本长期保存。
(5) 含量测定
未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各药品项下规定的方法测定,一般采用洗脱法或扫描法,测定各蛋白质组分的相对百分含量。 洗脱法 将洗净的膜条用滤纸吸干,剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带,分别浸于1.6%的氢氧化钠溶液中,振摇数次,**洗脱完全, 于一定波长下测定吸收度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位,同法操作作对照。先计算吸收值总和,再计算各蛋白组分所占百分率。
扫描法 将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪通过反射 (未透明薄膜) 或透射(已透明薄膜)方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图,横坐标为膜条的长度,纵坐标为吸收度,计算各蛋白组分的百分含量。亦可用微机处理积分计算。
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