在尿素或甲酰胺存在的条件下进行 RNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳能够破坏 RNA 的二级结构,使其电泳迁移率-与分子质量的对数成严袼的反比关系,同时其灵敏度要高于甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。
试剂、试剂盒 | 40% 聚丙烯酰胺溶液尿素甲酰胺5XTBE 缓冲液10X 加样缓冲液过硫酸铵TEMED染色液 1%AgNO3显色液 |
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仪器、耗材 | 垂直电泳装置水浴 |
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实验步骤 | (一)材料与设备
1) 垂直电泳装置
2) 水浴
3)40% 聚丙烯酰胺溶液: 丙烯酰胺 38 g,N,N-亚甲双丙烯酰胺 2 g,加水至 100 ml,完全溶解后过滤,保存于棕色瓶中
4) 尿素
5) 甲酰胺
6)5XTBE 缓冲液:Tris 碱 54 g, 硼酸 27.5 g,20 ml0.5md/LEDTA(pH8.0),加水至 1L
7)10X 加样缓冲液:10 mmol/LEDTA(pH8.0),0.2% 橙 G,50% 甘油
S)10% 过硫酸铵
9)TEMED
10) 染色液 1%AgNO3
11) 显色液:NaOH 10 g,Na2CO3 0.2 g,甲醛 2 ml 加水至 500 ml, 溶解完全后使用,需临时配制。
(二)操作方法
1) 灌胶:根据所分离 RNA 分子的大小、参照寡核甘酸长度与聚丙烯酰胺百分浓度的关系(表 5.1) 选择合适的胶浓度,并根据表 5.2 灌制变性聚丙烯酰胺凝胶
2) 预电泳:200V 条件下恒压电泳 15〜2Omin
3) 电泳: 在 RNA 样品中加入等体积的甲酰胺,振荡混匀,于 55℃ 加热 5 min, 以消除二级结构。加入 10X 加样缓冲液,200V 条件下用 0.5XTBE 电泳缓冲液恒压电泳。
4) 快速银染:电泳结束后,用蒸馏水洗胶两次;加入适量的染色液染色 10 min; 水冲洗 30s, 用少量显色液冲洗; 加入显色液至条带清楚。 收起 |
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注意事项 | 1) 灌胶后一旦拔去梳子,必须立即彻底清洗加样孔,否则由梳子带出的少量聚丙烯酰胺将会在孔中聚合,从而产生会使 RNA 条带变形的形状不规则的加样孔底面
2) 最好用同批配制的电泳缓冲液配胶和电泳,因为离子强度或 pH 值的细微差异都会产生缓冲液前沿,使 RNA 的迁移发生严重变形
3) 在电泳前最好进行预电泳,使过硫酸铵迁移出样品孔,并能将凝胶加温至最适于 RNA 电泳的温度
4) 在加样缓冲液中加入常规示踪染料溴酚蓝和二甲苯青是不可取的,因为这些染枓或其中的杂质可能与 RNA 迁移速率相同,会干扰利用紫外吸收观察 RNA 的效果 |
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