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小鼠输卵管卵母细胞采集与结构观察实验

2019.9.15

显微镜观察法

实验方法原理	哺乳动物的卵子发生在卵巢的卵泡内进行。在卵母细胞成熟发育阶段，初级卵母细胞发生生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)现象，并完成第一次成熟分裂(减数分裂，以同源染色体分离为特征)，并排出第一极体。一般认为，GVBD的发生和第一极体的排出是卵母细胞核成熟的标志。之后，次级卵母细胞进行第二次成熟分裂(一般为有丝分裂,以染色单体分离为特征)，并停滞在第二次成熟分裂中期。在这期间，完成胞质的最后成熟。这时，卵泡发育成熟，将处于第二次成熟分裂中期的卵母细胞连同周围的卵丘细胞随着卵泡液排出。排出的卵母细胞经过输卵管漏斗部进入输卵管，运行到受精部位输卵管膨大部（壶腹部）。卵母细胞只有受精后才完全成熟，完成分裂后期和末期，接着形成一个已受精的合子并放出一个小的第二极体。
实验材料	小鼠
试剂、试剂盒	生理盐水胚胎回收操作液
仪器、耗材	显微镜擦镜纸恒温水浴锅隔水式恒温培养箱器械盘手术剪手术镊子眼科剪眼科镊子眼科异物针表面皿卵母细胞吸管检卵杯酒精棉球吸管注射器针头针头盒酒精灯注射器针头孕马血清促性腺素人绒毛膜促性腺素酒精棉球镊子电子天平药勺青霉素瓶胶布记号笔
实验步骤	一、激素的分装、配制激素厂家生产的超排用生殖激素，如孕马血清促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素等。用于小鼠超排时，其包装剂量较大，一般不会一次用完。而由于这些激素的化学特性，一旦经过稀释，在溶液中的生物学活性会很快下降并失活，大剂量稀释后即使不用也不能保存多久。所以，在使用前应将市售包装进行分装。分装时，需要自行称量一个包装的激素净重，按照净重与该包装标示的激素单位，换算出每单位重量的激素单位数。然后根据每次超排需要使用激素的单位数，用精密电子天平对激素进行称重、分装，装入灭菌的干燥青霉素瓶中，用胶布密封每个小包装，并用记号笔标记日期、重量及激素单位数，放入4 ℃冰箱待用。临用前，取出一个小包装，按照每只小鼠腹腔注射0.2 mL(或0.5 mL)的溶液量，用溶剂(一般用灭菌生理盐水)进行稀释。二、小鼠超排处理日程安排与超排处理于实验开始的当天（0天）下午3:00～5:00，选择阴门淡粉红色的雌性青年小鼠，这时小鼠正处于临近发情开始前，进行超排处理效果较好。抓住小鼠后，腹腔注射PMSG 8～10单位。于注射PMSG后的48～50小时，再给每只超排鼠腹腔注射hCG 8～10单位，注射hCG 15~17小时，从输卵管壶腹部回收卵丘－卵母细胞复合体。三、小鼠卵母细胞采集及结构观察颈椎脱臼法处死实验小鼠，用70％的酒精棉球消毒腹部。在下腹部中间剪开一个小口(图4-2A)，两只手或用镊子分别抓起切口的上下部皮肤向头部和尾部牵拉，直到充分暴露腹部(图4-2B)。切开腹膜，将内脏向上翻，即暴露两侧卵巢和输卵管(图4-2C)。用眼科镊子夹住子宫与输卵管联结处，用锋利的剪刀剪开输卵管系膜(图4-3A)，之后先剪断卵巢和输卵管之间的联系结构(图4-3B)，再剪断子宫与输卵管联结处，即得到输卵管部分，将输卵管转移到盛有PBS的表面皿中。用眼科剪尽量除去输卵管上的脂肪，并冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨碍检卵。由于小鼠输卵管非常细，不容易直接冲洗管腔。将表面皿置于实体显微镜载物台上，在20或40倍镜下找到输卵管膨大部（壶腹部）(图4-4)，用一支眼科异物针固定输卵管，用另一支异物针撕开壶腹部，一般情况下，卵丘-卵母细胞团会自动移出。初学者对输卵管膨大部判断不准时，可用异物针纵向撕开整个输卵管。此时，卵母细胞周围包裹卵丘细胞，多个卵聚集成积云状。将卵母细胞团移到含透明质酸酶的液体中，卵母细胞就会分散成单个细胞。用较细的吸管检出卵母细胞到检卵杯中，用PBS洗3次，在实体显微镜下观察卵母细胞的形态结构。卵母细胞通常为圆球形。小鼠卵母细胞较小，直径为70~90um左右，由透明带包围卵胞质构成。透明带外有放射冠，是由具有胞质突起的呈放射状排列的细胞(卵丘细胞)构成的。MII期卵母细胞成熟的标志是第一极体排出，小鼠卵母细胞的第一极体较大，容易辨认。展开
其他	卵母细胞通常为圆球形。小鼠卵母细胞较小，直径为70~90um左右，由透明带包围卵胞质构成。透明带外有放射冠，是由具有胞质突起的呈放射状排列的细胞(卵丘细胞)构成的。MII期卵母细胞成熟的标志是第一极体排出，小鼠卵母细胞的第一极体较大，容易辨认。