本实验目的是：（1）掌握小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集方法；（2）掌握血球计数板法精子计数和运动能力检测的方法；（3）通过睾丸、附睾及输精管精子运动能力检测，认识精子在睾丸产生后，在附睾内成熟的过程；（4）掌握精子抹片方法；（5）掌握染色法进行精子结构观察和顶体结构观察的方法，认识精子的正常结构。
血球计数法
| 实验方法原理 | 哺乳动物的精子形成后必须经过在附睾内发生一系列形态、生理和生化方面的变化而最终达到成熟后，才能获得向前运动的能力，这种向前运动是精子受精能力的重要指标。哺乳动物精子包括头部和尾部二个主要部分，颈部介于头部和尾部之间，形成头部和尾部的连接。精子头部主要由核组成，头部前端是顶体，顶体包围核的前端形成帽状。精子颈部变细并形成头部和尾部的连接。尾部是精子的运动器官，可以分为中段、主段和末段。 |
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| 实验材料 | 小鼠 |
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| 试剂、试剂盒 | 龙胆紫酒精福尔马林磷酸盐缓冲液姬姆萨液 |
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| 仪器、耗材 | 吸水纸滴瓶滴管载玻片盖玻片剪刀胶布记号笔隔水式恒温培养箱CZB液KSOM液注射器器械盘镊子手术剪眼科剪眼科镊眼科异物针表玻皿试管显微镜擦镜纸恒温水浴锅血球计数板 |
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| 实验步骤 | 一、精子采集
左手捏小鼠尾部，右手持镊子，或以图4-1所示方法，以颈部脱臼法处死实验鼠。使处死的小鼠仰卧，用用75 %酒精棉球消毒腹部开口部位被毛及皮肤。剪开腹壁，暴露生殖系统。无菌采取分离睾丸、附睾及输精管。在含培养液的表玻皿中，用眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂肪，并冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨碍精子观察。
将分离并清洗干净的睾丸、附睾及输精管，用眼科剪再分离为睾丸、附睾尾及附带的小段输精管、其余部分的输精管三部分，弃去附睾头。采集睾丸精子时，将睾丸横切为若干段或组织块，在表面皿中，加1 mL培养液，用眼科镊子轻轻挤压睾丸组织块，把精子挤入培养液中，去掉组织块。于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育20分钟，使精子自行散开。
采集附睾尾精子时，将其剪成几段，用眼科镊子轻轻挤压附睾和输精管，把精子挤入培养液中，去掉附睾和输精管。于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育20分钟，使精子自行散开。采集输精管精子时，由于小鼠输精管非常细，不能直接冲洗管腔，将输精管放入含有1mL 培养液的表面皿内，在实体显微镜下，用一支眼科用异物针固定输精管，用另一支异物针向相反方向纵向撕开输精管，精子会浮游到稀释液中。将大块输精管组织拨开，用吸管连同精子吸出液体部分，装于2 mL具塞试管中暂存。
二、精子运动能力检查
用滴管吸取精液，放于血球计数板的计数室与盖玻片接触处，使精液自然流入计数室中。计数中间5个中方格(对角5个或四角及中间)内80个小方格的精子数，计数值为X。计算时，先计数死精子的X1值，将计数板置于50 ℃水浴锅中的搪瓷盘中，在50 ℃条件下10 min杀死精子，计数总精子数X2值，(X2-X1)/X2为精子运动能力。计数时每份精子用三个计数板重复计数三次，取平均值。
三、精子整体结构观察
取1小滴保存精液在载玻片上，将样品滴以拉的形式制成抹片。用0.5 %龙胆紫酒精染色3min,自然干燥、水洗后镜检。镜下可观察到大多数为结构正常的精子，部分为畸形精子，如头部畸形(如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不明显、皱缩、缺损、双头等)，颈部畸形(颈部膨大、纤细、屈折、不全、双颈等)，尾部中段畸形(膨大、纤细、弯曲、屈折、不全、双体等)，尾部主段畸形(弯曲、屈折、回旋、短小、长大、双尾等)分类计数。有的精子尾部发育未完成，为未成熟精子，可视为畸形精子。
四、精子顶体结构观察
精液抹片自然干燥2～20 min，以1～2mL的福尔马林磷酸盐缓冲液固定15 min，水洗后自然干燥。用姬姆萨工作液染色90 min，水洗，风干。置于1000倍显微镜下用油镜观察、计数顶体异常精子。镜下可观察到大多数精子顶体结构正常，部分精子顶体异常，精子顶体异常主要表现为肿胀、缺损、部分或完全脱落。
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| 注意事项 | 在含培养液的表玻皿中，用眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂肪，并冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨碍精子观察。 |
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