果蝇白眼突变基因的克隆
【实验目的】
掌握T克隆的原理和方法。
了解质粒提取的原理和方法。
【实验原理】
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA 连接酶的作用下，有Mg2+
、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq
DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector
末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
【实验器材】
F 试剂耗材：Taq
DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR
管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。
F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。
【方法步骤】
（一） 引物设计
从NCBI上下载果蝇的白眼突变基因序列（GenBank登录号：X51749），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。
（二） 目的基因片段的PCR扩增
25µl反应体系：
模板cDNA 1.5µl
10×reaction buffer 2.5µl
2.5mM MgCl2 2µl
2.5mM dNTP 2µl
上游引物 1µl
下游引物 1µl
Taq DNA聚合酶 0.2µl
加ddH2O至总体积 25µl
按照以下程序进行PCR扩增：
94℃预变性4min；
94℃变性40s，55℃退火40s，72℃ 延伸1min，共30个循环；
72℃总延伸10min，4℃保存。
取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。
（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收
将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
（四）目的基因片段与克隆载体的连接
PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下：
纯化回收的PCR产物 4μl
Ligation SolutionⅠ 5μl
pMD18-T Vector DNA 1μl
混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。
（五）连接产物的转化
(1) 取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；
(2) 加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；
(3) 42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；
(4) 加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；
(5) 制备X-gal平板：取40μl X-gal、 4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；
(6) 取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。
（六）重组质粒的筛选
分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl 氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：
(1) 取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；
(2) 加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；
(3) 加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；
(4) 加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；
(5) 4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；
(6) 以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟；
(7) 4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；
(8) 加入400μl三氯甲烷摇匀， 4℃，12000rpm离心5min；
(9) 取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；
(10) 弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；
(11) 加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。
(七) 重组质粒的测序验证
将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。
【实验结果】
2. 目的基因的PCR电泳结果。
3. 质粒电泳结果。
4. 测序验证结果。
【实验思考】
1. 目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。
2. 影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。
3. 简述热激法转化和蓝白筛选的原理。
4. 简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。
【参考文献】
1. J.萨姆布鲁克， D.W 拉塞尔. 《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，2002.
2. Pepling M, Mount S M. Sequence of a
