红细胞粘附功能测定
（一）花环法测定红细胞CD35分子
红细胞膜上Ｃ3b受体（CD35）可与补体致敏的酵母菌粘附形成花环（RBC－Ｃ3bＲ花环）；红细胞膜上粘附的ＩＣ中Ｃ3b分子可与未致敏的酵母菌粘附形成花环（ＲＢＣ－ＩＣ花环）。RBC－Ｃ3bＲ和RBC－IC花环率可作为红细胞免疫粘附功能的指标，如二项指标都低下，判为原发性红细胞免疫功能低下，为红细胞膜Ｃ3b受体受到破坏和影响所致；如果RBC－Ｃ3bＲ花环率降低，而RBC－IC花环率增高，为继发性红细胞免疫功能低下，是由于CIC增加，红细胞粘附IC过多引起的。此两项试验可作为临床上免疫性疾病的疗效及预后检测指标，亦可作为器官移植、疾病发病机理与药物筛选的红细胞免疫指标，以及用于中医中药作用的免疫学研究。
【材料】
１动物：昆明种小白鼠。
２试剂：肝素，生理盐水，酵母菌，0.25%戊二醛。
３器材：离心机，细胞计数板，二层定性滤纸，光学显微镜，试管，水浴箱，玻片。
【方法】
１制备待测红细胞悬液：将肝素抗凝的血用生理盐水洗涤离心3次，2000ｒ/min离心3～5min，计数后配成1×108/mL红细胞悬液备用。
２酵母菌培养：取酵母菌菌种接种于沙保培养基，28℃培养24ｈ即可。
３制备补体致敏的酵母菌悬液：将酵母菌用生理盐水洗涤3次后，配成１%悬液，水浴内煮沸20min，充分混匀。用二层定性滤纸（或16层纱布）过滤，除去小凝块，在低倍镜下呈单个酵母菌细胞分散状态，加等量小白鼠血清，混匀后置37℃水浴致敏15min。用生理盐水洗涤１次，2500ｒ/min离心10min。去尽上清，用生理盐水重混悬。计数后配成1×10８/mL补体（C3）致敏的酵母菌悬液。
４取两支小试管，每管加待测红细胞悬液100uL，第一管再加补体致敏酵母菌悬液
100uL，第二管加未致敏的酵母菌悬液100uL，摇匀放37℃水浴30min；取出用手腕轻轻摇匀，加生理盐水200uL；混匀后，再加0.25%戊二醛75uL轻轻混匀；分别取1/3量水平涂片，吹干，加甲醇固定；用瑞氏法染色，油镜下计数。
５红细胞上粘附2个或2个以上酵母菌者为花环。分别计数200个红细胞，算出花环阳性细胞百分率。第一管为RBC－C3b受体花环率，第二管为RBC－IC花环率。
【注意事项】
１酵母菌要分散不能自凝，要充分吹打分散。
２水浴时防止红细胞破坏。
３细胞计数要准确，红细胞与酵母菌比例要合适。
（二）红细胞对肿瘤细胞免疫粘附能力的测定
肿瘤细胞可通过旁路途径激活并粘附补体，与红细胞C3b受体结合，红细胞还可识别肿瘤抗原与肿瘤细胞粘附，攻击癌细胞，形成花环状。这为研究肿瘤病人红细胞与血清中补体样物质共同歼灭肿瘤细胞能力的变化规律及机理提供了有力的手段。
【材料】
１动物：昆明种小白鼠。
１试剂：0.25%戊二醛，生理盐水，肿瘤细胞。
２器材：试管，玻片，吸管，离心机，水浴箱，100uL加样器。
【方法】
１靶细胞准备：靶细胞为肿瘤细胞，经生理盐水洗涤一次，1000ｒ/min离心１０min后，配成1×10６/mL悬液。
２制备新鲜血清和待测红细胞悬液：小鼠眼球取血，其中一只取出的血置于加了肝素的试管中，然后水平离心2000ｒ/10min后，取上清即为小鼠新鲜血清；另一只取出的血直接置于试管中，用生理盐水洗涤3次（每次水平离心2000ｒ/5min），制备成1×10８/mL待测红细胞悬液。
3测红细胞免疫粘附活性，采用“直向肿瘤红细胞花环实验”：取小鼠新鲜血清100uL加肿瘤细胞悬液100uL混匀，放37℃水浴30min；用生理盐水洗涤一次，水平离心２０００ｒ/5min后，加待测红细胞悬液50uL混匀，放37℃水浴30min；取出加100uL生理盐水混匀后，再加0.25%戊二醛50uL混匀，水平涂片，瑞氏染色。肿瘤细胞呈蓝色，红细胞呈红色，肿瘤细胞粘附上3个或3个以上红细胞者为花环，计数100个癌细胞，算出花环率。
【注意事项】
１计数细胞时要准确，红细胞与肿瘤细胞比例要合适。
２水浴时避免水致红细胞破坏。
３戊二醛加入前后都应轻轻混合，避免假花环出现。
