临床基因扩增检验实验室样本的处理办法
(一)标本的采集
常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时,应使用一次性密闭容器,如真空采血管。当使用非密闭采样系统时,如尿、分泌物和骨髓的采样,必须注意防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。
玻璃器皿在使用前应高压处理,因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是热灭菌,250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。
全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝,因为肝素是Taq酶的强抑制剂,而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。
临床用于RNA(如HCV RNA)扩增检测的血标本建议进行抗凝处理,并尽快(3小时以内)分离血浆,以避免RNA的降解。如未作抗凝处理,则抽血后,必须在1小时内分离血清。
(二)标本的稳定化处理
用于DNA扩增检测的标本,采集后一般不需要特殊的稳定化处理,但标本应及时送至实验室。
由于RNA易受RNA酶的降解,因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理,如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活,因此在采集标本时,可将标本材料如血清或血浆按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的试管中,从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后,标本一般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目,上述稳定化处理方法的效果究竟如何,要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。
(三)标本的运送
标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本。通常在运送时,应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本,如果未经稳定化处理,则必须速冻后,放在干冰中运送。
(四)标本的贮存
临床体液标本如血清/血浆等可于-70℃下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA缓冲液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃即可。用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。
(五)标本的处理(核酸提取)标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤,在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前,应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。通常,核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致,抑制物可能来源于标本本身(如血红素及其前体或降解产物)或核酸提取过程
