NAD 激酶试剂盒说明书
NAD 激酶(NAD kinase, NADK)试剂盒说明书
分光光度法 50 管/24 样 注 意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义: NADK(EC 2.7.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是目前所发现的生物体内惟一能够 催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶,可催化 NAD(H)以 ATP 或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行 磷酸化反应,生成 NADP(H)。因此,NAD 激酶在合成 NADP(H)以及调节 NAD(H)与 NADP(H)的平衡上具 有重要作用。 测定原理: NADK 催化 NAD+磷酸化,生成 NADP+;NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为 NADPH;在 340 nm 下 测定 NADPH 增加速率。可反映出 NADK 活性的大小。 需自备的仪器和用品: 可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿和蒸馏水。 试剂的组成和配制: 提取液:液体 50 mL×1 瓶,4℃保存; 试剂一:液体 25 mL×1 瓶,4℃保存; 试剂二:液体 50 mL×1 瓶,4℃保存; 试剂三:粉剂×1 瓶,-20 ℃保存; 试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃保存; 样本测定的准备: 1、细菌、细胞或组织样品的制备: 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提 取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细 胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上 待测。 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提 取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 2、血清(浆)样品:直接检测。 测定步骤: 1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。 2、将试剂一和试剂二 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 15min 以上。 3、工作液Ⅰ的配制:在试剂三中加入 12mL 试剂一,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止 反复冻融; 工作液Ⅱ的配制:在试剂四中加入 45mL 试剂二,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止 反复冻融; 4、加样表 试剂名称(μL) 测定孔 对照管 QQ 1019057849 样本 100 100 工作液Ⅰ 400 试剂一 400 充分混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 15min,立即煮沸 2min(盖紧,防止水分散失)冰浴冷却,10000g,25℃离心 10min,取上清 上清液 200 200 工作液Ⅱ 800 800 加完试剂混匀,室温静置 15min,340nm 下测定吸光值,ΔA=A 测定-A 对照。 NADK 活性计算: 1、血清(浆)NADK 活力的计算: 单位的定义:每 mL 血清(浆)每分钟生成 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。 NADK(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109 ]÷V 样÷T=53.59×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 NADK 活力的计算: (1)按样本蛋白浓度计算: 单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。 NADK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr (2)按样本鲜重计算: 单位的定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。 NADK(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109 ]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=53.59×ΔA÷W (3)按细菌或细胞密度计算: 单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。 NADK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109 ]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.107×ΔA V 反总:反应体系总体积,5×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径, 25px;V 样:加入样本体积,0.1 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,15 min;Cpr:样本 蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万