液体培养方法在结核病和耐药结核病诊断中的应用
一、培养方法
结核杆菌培养是依据结核杆菌的生长规律，根据营养和代谢需要的条件，人工营造提供出有利于结核杆菌生长而抑制其他细菌生长的环境，达到分离出结核杆菌的目的。结核杆菌培养中依据培养基形状的不同主要分为固体培养基和液体培养基，据此可将培养方法分为固体和液体培养。固体培养主要有以鸡卵液为基质并含高浓度孔雀绿抑制其他细菌生长的罗氏、改良罗氏培养基及以琼脂为基质的Middlebrook7H10或7H11。固体培养成本低、污染率低，培养成功率高，通过观察形成的菌落形态能得到初步的鉴别，适于各级实验室的广泛使用，但固体培养相对时间较长，阴性培养结果需要观察8周，阳性培养结果平均需要3～4周才能观察到明显的菌落，较长的培养时间降低了临床应用价值。
二、液体培养
液体培养方法即结核杆菌在液体培养基中生长，因液体培养基营养成分复杂并往往添加了促生长因子，能为结核杆菌的生长提供充分的营养；且结核杆菌在液体环境中生长能充分接触营养物质对营养物质的吸收更加充分；此外，液体培养还加人多种的抗菌素能抑制杂菌的生长。
(一)手工法培养
手工法使用的液体培养基以Middlebrook系列为主为复合型培养基，有基质、营养增加剂和抗生素组成，也有商品化的组分出售，使用时将不同组分混合，此种培养基多用于科研、疾病监测。主要有Middlebrook 7H9和Sauton培养基。
(二)自动法培养
为了能提高结核杆菌检测效能，简便培养操作、缩短培养时间，自动化的结核杆菌培养系统被发展。
1．BACTEC 460系统：1969年Deland and Wagner发明了采用放射性14C棕榈酸为底物，检测细菌在液体培养基生长过程中释放出的含有放射性的14CO2，计算出细菌生长指数GL的半自动检测系统。1980年该项技术被应用到了结核杆菌培养中，BACTEC 460 TB分枝杆菌培养和药敏检测系统出现了。该检测系统能自动检测结核杆菌在液体培养基中的生长状况，对涂阳和涂阴标本都有很好的分离培养效果，与传统L—J培养方法比较分离培养临床标本的阳性率能提高15％～20％，且培养时问较L—J培养方法的3～5周时间缩短为8～14 d。
2．BACTEC MGIT 960系统：BACTEC MGIT 960系统是在BACTEC 460 TB基础上改进的，使用了分枝杆菌生长指示管(MGIT)。MGIT培养管底部的硅树脂中含有氧淬灭荧光剂，当分枝杆菌生长过程中吸收散布在培养管中的O2，排放出CO2，随着管中O2的逐渐损耗，荧光剂不再被抑制，当使用紫外光进行观察时，MGIT培养管便会发出荧光。并且，荧光的强度直接与O2的消耗成正相关。MGIT在BACTEC MGIT 960系统上使用，该系统能定时收集结核杆菌生长过程中产生的化学信号等变化，自动报告监测结果，实现了结核杆菌培养的全自动化的。BACTEC MGIT 960解决了BACTEC 460 TB放射物质污染的问题，对环境和实验人员更加的安全。
3．BacT/ALERT 3D系统：BacT/ALERT 3D检测系统是通过检测液体培养基中释放CO2的量来确定是否有细菌生长的。当分枝杆菌在培养管中生长过程中代谢产生CO2，这时培养瓶底部的透气传感器颜色会发生变化使系统监测的反射率增加，发光二极管(LED)将光线投射到传感器上，由一个光电探测器测量反射光，产生的CO2越多，则被反射的光就越多，将产生CO2的量值与标本瓶中初始的CO2水平相比较，通过仪器报告阳性或阴性。
4．VersaTrek分枝杆菌液体培养系统：分枝杆菌液体培养VersaTrek依据压力传感检测技术，集中了血培养和结核杆菌培养，但该技术因生物安全和操作技术缺陷限制了在结核病实验室的使用。
总之，液体培养能提高结核杆菌分离阳性率，缩短培养时间；但是，液体培养不能根据肉眼观察菌落形态，培养阳性产物，需涂片染色镜检判断是否是结核杆菌；自动化的检测设备能简便检测操作，降低实验室生物安全风险，但成本大幅的提高，增加了诊断费用。
三、药敏试验培养方法
为获得结核杆菌是否对药物的耐受性，经常在体外使用药敏试验培养方法进行检测，药敏试验方法就是在含一定药物的培养基上接种一定数量的结核杆菌，当结核杆菌能在抑制其生长的最低药物浓度(MIC)下生长时被界定为耐药菌株，反之则定为敏感菌株。药敏试验使用的培养基主要有固体和液体培养基；主要的方法有绝度浓度法和比例法。绝度浓度法将10-3 mg结核杆菌接种于高、低两个药物浓度的培养基上，试验结果能在一定程度上反映结核杆菌的耐药程度，但绝对浓度法对结核杆菌的接种量要求十分严格，接种量过大会产生假耐药结果。比例法能减少绝对浓度法对结核杆菌接种量的严格要求，比例法将高、低两个浓度的结核杆菌同时接种于含药和空白对照培养基上，通过比较含药和空白培养基上生长的CFU，当生长在含药培养基的菌群大于空白培养基生长菌群1％时，则判为该结核杆菌耐药，反之，则判为敏感。
四、液体药敏试验培养方法
2008年WHO制定和发布了二线抗结核药物的药敏试验指导性文件。发布规定了一、二线药物试验中不同培养基使用的药物含量，固体培养基有LJ、7H10和7H11，液体培养基为BACTEC 460和BACTEC MGIT 960。当今结核病实验室使用的液体药敏试验方法主要为BACTEC MGIT 960的改良比例法药敏试验。BACTEC MGIT 960有一线结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素)培养基，还有独特的吡嗪酰胺培养基，因吡嗪酰胺仅能在酸性的环境下发挥作用，在中性pH值培养基不能发挥作为，一般培养基不能进行此项检测。对于二线药物，BACTEC MGIT 960尚未推出商品化的培养基，需要使用者自己添加药物配制，WHO推荐了用于BACTEC MGIT 960培养基中的二线药物含量。
五、质量控制
实验室中只有受到质量控制的试验方法才能保证检测结果的准确性。《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》是国家结核病参比实验室参照WHO推荐的方法对结核杆菌培养制定的质量控制程序，对于常规结核病实验室培养的质量控制有两个参考指标，一定时期内的污染率和涂阳培阴率，培养污染率应控制在2％～5％；针对初治结核病患者的涂阳培阴率应控制在10％内。若培养污染率小于2％，表明该实验室在分离培养前期去污染过程分枝杆菌被杀灭太多，存在过度处理的问题；若污染率大于5％，又表明去污染不充分杂菌没有被杀灭，前处理不够。但通常液体培养污染率要高于固体培养，对于液体培养更加要防止操作过程的污染。涂阳培阴率若高于10％，则表明该实验室涂片显微镜检查质量有问题或培养技术达不到要求。
总之，结核杆菌液体培养能提高结核病检测灵敏度，液体培养和液体药敏试验能缩短检测时间，自动化的操作能提高检测效率及实现结果判定的标准化；液体培养和液体药敏试验适用于结核病及耐药结核病的诊断发现、疗效评价及流行病学监测。
